En España, al cultivo del peral (Pyrus communis L.) se dedican unas 38.000 hectáreas, lo que supone el cuarto lugar en importancia económica entre las distintas especies frutícolas, detrás del almendro, melocotonero y el manzano. La producción de pera en nuestro país es de unas 672.000 toneladas (MAPA, 2003), gran parte de la cual, sobre el 80%, se localiza en la Cuenca del Ebro.

El decaimiento del peral o "pear decline" (PD) es una de las enfermedades más importantes que afectan a esta especie, reduciendo considerablemente la productividad de las plantaciones afectadas, e incluso la muerte progresiva de los árboles cuando el decaimiento es muy avanzado (NICHOLS et al., 1965; BATISTE Y BULLA, 1980; REFATTI, 1964; RALLO, 1973; GIUNCHEDI et al., 1982). En la actualidad, la enfermedad está extendida por Europa, América del Norte y del Sur, así como en Australia (MCLARTY, 1948; KRISTENSEN, 1976; NEMETH, 1986; MALINOWSKI et al., 1996; SHNEIDER Y GIBBS, 1997; SERRONE et al., 1998). En España, la incidencia del decaimiento del peral se comenzó a evaluar a finales de los años 60 (RALLO, 1973), pero fue posteriormente, con el aumento de la población de Cacopsylla pyri a nivel global (HIBINO et al., 1971, DAVIES et al., 1992, FRANCO, 1988) cuando se extendió de manera más preocupante (AVINENT et al., 1997), aunque no se dispone de una información actual sobre su incidencia.

 

INTRODUCCIÓN

El decaimiento del peral está causado por un fitoplasma del grupo 16S X subgrupo C (LEE et al., 1998) cuyo genoma tiene un tamaño de 635 kbases (LAUER Y SEEMÜLLER, 2000). La transmisión de este fitoplasma se produce a través del injerto y por los insectos psílidos del género Cacopsylla, debido a que se localiza principalmente en el floema de la planta huésped. El fitoplasma produce la necrosis de los tubos cribosos por debajo de la línea del injerto (AVINENT Y LLACER, 1996), manifestándose en la planta una serie de síntomas poco específicos. La sintomatología observada varía según la virulencia del fitoplasma y la sensibilidad del material vegetal, tanto de la variedad como del patrón, pudiendo ser clasificado su desarrollo como decaimiento lento o rápido (GARCÍA-CHAPA et al., 2003).

En el decaimiento lento, los árboles pueden sobrevivir durante varios años, en los cuales, los brotes van reduciendo progresivamente su crecimiento, disminuyendo la frondosidad y el tamaño de las hojas así como, produciéndose un prematuro enrojecimiento y caída de las hojas (Figura 1). Todo ello conlleva una disminución paulatina de la producción, como consecuencia de la necrosis de la parte de sus flores y la disminución de los frutos cuajados. Después de unos años de evolución de la enfermedad, la planta manifiesta una parálisis total en el desarrollo y muere. Este decaimiento lento puede transformarse en rápido dependiendo del material vegetal, las condiciones climáticas, edáficas y biológicas, así como de las continuas reinfecciones causadas por los ataques del vector Cacopsylla pyri. Así, se ha observado como, en períodos estivales muy calurosos y secos, los árboles afectados por la enfermedad, pueden en pocas semanas mostrar un marchitamiento general y morir (AGRIOS, 2005).

El decaimiento rápido se ha observado principalmente en plantas injertadas sobre patrones orientales (P. calleriana, P. pyrifolia, P. serótina y P. ussuriensis), y se caracteriza por un amarillamiento de las hojas y en pocas semanas, la muerte de la planta como consecuencia de la obturación general de los tubos cribosos en la zona de la discontinuidad vascular del injerto por el fitoplasma.

Estos síntomas pueden llevar a diagnósticos erróneos, ya que son comunes a los producidos por otros problemas, como incompatibilidad patrón-injerto, anillamiento, asfixia radicular, carencias nutritivas, ciertos virus como el virus ACLSV (Apple chlorotic leaf spot virus), el ASPV (Apple stem pitting virus), el jaspeado amarillo del membrillero (Quince yellow blotch virus), las manchas del hollín sobre membrillero (Quince sooty ringspot virus) (LEMOINE, 1986; LLACER, 1988; JELKMANN et al., 1992; NEMETH, 1986).

Hasta hace pocos años, la detección del fitoplasma causante del decaimiento del peral, se realizaba mediante técnicas de microscopia óptica, tras la tinción con fluorocromo (DAPI), para observar la presencia de fitoplasmas en los tubos cribosos de plantas bajo sospecha o en ensayos de transmisión del fitoplasma (SEEMÜLLER et al, 1994).

La detección del fitoplasma también se puede realizar mediante técnicas serológicas, como el ELISA, y de hibridación DNA-DNA, aunque su efectividad puede estar limitada por la pequeña concentración en la que se encuentran los fitoplasmas en los tejidos vegetales y por su distribución irregular en el árbol enfermo. Por ello, en la última década se han desarrollado métodos de detección y de caracterización de fitoplasmas basados en técnicas PCR (AHRENS Y SEEMÜLLER, 1992; LORENZ et al., 1995;) que incrementan enormemente la sensibilidad y seguridad en la detección del fitoplasma, incluso antes que las plantas muestren síntoma alguno. Los avances en el secuenciado de los genomas de los diferentes fitoplasmas, han permido identificar las regiones del genoma que se encuentran altamente conservadas y las que son mas variables, y diseñar cebadores universales y específicos que permitan una eficiente detección de los distintos fitoplasmas (SMART et al., 1996) y clasificarlos en los principales grupos filogenéticos (SEEMÜLLER et al., 1998, LIU et al., 2007).

 

La enfermedad del decaimiento del peral, al igual que otras enfermedades producidas por fitoplasmas, no tiene cura. La planta enferma sufre una infección generalizada que perdura durante toda la vida de la planta. En una plantación comercial, una vez detectada la infección, la única solución para el fruticultor es arrancar y replantar con material sano. Sin embargo, en una colección de germoplasma, el problema de la infección resulta mucho más grave, ya que a veces no es posible un arranque inmediato hasta que no se ha obtenido nuevo material vegetal saneado de las variedades afectadas.

La actuación de saneamiento debe realizarse en el plazo más breve posible, ya que tal como evaluaron SPAAR et al., (1972), tras ocho años de la primera infección en una parcela de peral, la mortalidad puede superar el 25% de las plantas, y en general en una colección de germoplasma muchas de las variedades presentes son muy difíciles de volver a encontrar.

Por otra parte, los tratamientos para el saneamiento de plantas infectadas por virus y fitoplasmas, se centran fundamentalmente en la quimioterapia, termoterapia y técnicas de cultivo in vitro, que son aplicadas bien de forma individual o de forma combinada, hasta lograr la eliminación del agente causante de la enfermedad en una parte de la planta, y regenerar posteriormente a planta entera (HORMAZA et al., 2002).

Algunos fitoplasmas patógenos de las plantas caducifolias suelen presentar fluctuaciones estacionales, de manera que los fitoplasmas alcanzarían las mayores concentraciones en otoño, y con llegada del invierno la concentración disminuiría drásticamente en la parte aérea, permaneciendo en mayor concentración en la zona radicular, para volver a colonizar la parte aérea durante el siguiente período vegetativo, con la nueva formación de tubos cribosos (TAHAMA, 1975; SCHAPPER Y SEEMÜLLER, 1982; POGGI POLLINI et al., 1995). Ciertos autores indican que la cantidad de fitoplasma presente en la parte aérea durante la latencia invernal es pequeña (ROSENBERG Y JONES, 1977, SCHAPPER Y SEEMÜ-LLER, 1982), pero suficiente para producir su transmisión mediante el injerto de yemas dormidas (ERREA et al., 2002), siendo altamente desaconsejable utilizar esta técnica para realizar el saneamiento del material vegetal infectado.

En teoría, para conseguir plantas sanas, sería suficiente la propagación de partes de las plantas que se suponen libres de fitoplasmas, sin necesidad de aplicar ningún tratamiento terapéutico. Sin embargo, la principal dificultad consiste en la confirmación de que esa parte se encuentra efectivamente libre de fitoplasma.

En la colección de germoplasma de peral del Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA), se ha detectado en los últimos años, plantas que muestran síntomas de la enfermedad del decaimiento del peral. Ante el riesgo de la muerte de alguna planta o de la pérdida de alguna variedad y aprovechando la necesidad de la renovación de la colección, se esta realizando un gran esfuerzo para su saneamiento.

En este manuscrito se describen los trabajos que se están abordando para la creación de esta nueva colección.

 

Material y métodos

Material vegetal

La colección de germoplasma de peral del CITA está compuesta por 95 variedades comerciales internacionales y 47 variedades autóctonas. En esta colección se recogen también las nuevas accesiones de la prospección de genotipos de interés que está realizando la Universidad de Lérida en el nor-este de la península ibérica.

La mayoría de las variedades están injertadas directamente sobre el membrillero ?BA-29?, existiendo algunas de ellas injertadas sobre membrillero ?A? o ?C?, con intermediario de ?Decana de Comicio? o ?Mantecosa Hardy?.

La colección de germoplasma de peral del CITA es utilizada como Colección de Referencia Española y su material vegetal se emplea como referencia para la realización de los informes DUS (distinguibilidad, uniformidad y estabilidad) de las nuevas variedades de peral que solicitan protección o registro varietal a la Oficina Española de Variedades Vegetales (OEVV) y a la Oficina Comunitaria de Variedades Vegetales (OCVV).

 

Estrategia planteada en la renovación de la colección

La actual colección de germoplasma de peral del CITA fue plantada principalmente en el año 1989, aunque durante estos últimos años ha ido recibiendo nuevas accesiones. Así pues, la mayoría de las variedades que la componen son plantas de unos 18 años de edad. Ante la necesidad de renovación de la colección por su edad y la conciencia de que la incidencia de la enfermedad del decaimiento del peral puede empezar a ser un problema para la expresión del potencial de las distintas variedades, o el posible riesgo de la pérdida de alguna de ellas, se llevó a cabo un plan de saneamiento de la colección para realizar su renovación. Así, desde el primer testado de la presencia del fitoplasma en la colección en la primavera del 2000 hasta la actualidad, se ha ido realizando el saneamiento in vitro de las variedades infectadas con el fitoplasma comenzando por aquellas que mostraban síntomas evidentes de la misma y terminando por aquellas que no mostraban síntomas, pero la detección los métodos de PCR indicaban la presencia del fitoplasma. A comienzos de abril de 2005, se injertaron las variedades en las que el testado de la presencia del fitoplasma había sido negativo. En esta ocasión se utilizó el "injerto de taller omega" (Figura 2) sobre el patrón OHF-87. Se consideró este portainjertos el mas adecuado para la crear la nueva colección, ya que confiere a la variedad un vigor intermedio (CARRERA et al., 2005) y se evita la expresión de incompatibilidad en el injerto al tratarse de un patrón franco de peral.

A lo largo de todo éste proceso de renovación y saneamiento, se han estado realizando testados rutinarios de control de la presencia del fitoplasma, tanto en el material vegetal injertado como en el material vegetal procedente del cultivo in vitro de ápices con crecimiento activo.

 

Diagnóstico de la enfermedad

Extracción de ADN del material a diagnosticar. La extracción del ADN genómico se realizó en hojas del material vegetal utilizando el protocolo descrito por DOYLE Y DOYLE (1990), con mínimas variaciones.

Se realizaron al menos dos extracciones del material vegetal en diferente tiempo del período vegetativo para la comprobación del resultado de los testados.

La cantidad de ADN extraída en cada muestra fue cuantificada mediante un espectrofotómetro y se diluyó a 10 ng/ul para realizar las reacciones de PCR.

 

Realización de la PCR anidada. Las reacciones de amplificación se realizaron mediante la PCR anidada, realizándose la primera reacción mediante cebadores universales que amplifican el DNA de la mayoría de los fitoplasmas, fU5/rU3 (LORENZ et al., 1995) y fP1/rP7 (SMART et al., 1996) y la reamplificación con cebadores específcos para el fitoplasma causante del decaimiento del peral fPD/rPDS (LORENZ et al., 1995). Las condiciones de la amplificación para las reacciones PCR y la electroforesis de los fragmentos de ADN amplificados (Figura 3) fueron similares a las detalladas en ERREA et al. (2002).

 

Saneamiento del material vegetal

El saneamiento de las plantas en las que se detectó la presencia del fitoplasma causante del decaimiento del peral, se realiza mediante el cultivo in vitro de ápices con crecimiento activo. Para ello, se escogió de cada variedad enferma la planta que mejor aspecto general presentaba y se recogieron diez ápices en crecimiento activo por variedad durante el mes de abril y comienzos de mayo.

Estos ápices fueron lavados y esterilizados en soluciones de alcohol 70% durante 5 minutos y de hipoclorito sódico al 10% durante 20 minutos. Tras tres lavados en agua estéril ya en la cámara de flujo laminar se procedió al establecimiento in vitro en medio básico (MS) sin hormonas, durante 15 días (MURASHIGE Y SKOOG, 1962). Transcurrido este tiempo los explantos fueron transferidos a un medio de proliferación (Figura 4), compuesto por el MS suplementado con 2,25 ppm de BAP, 0,1 ppm de GA3 y 0,1ppm de IBAK. El material se repico cada 4 semanas durante 5 meses y se mantuvo en una cámara de cultivo a una temperatura constante de 25ºC con un fotoperiodo de 16 horas y provisto de lámparas fluorescentes de luz blanca de 2.500 - 3.000 lux. Una vez obtenidos suficientes brotes, se transfirieron a un medio de enraizamiento bajo en nitratos, en el que respecto al medio de proliferación, las sales se reducen a la mitad de concentración, se suprimen el BAP y el GA3, y se aumenta la concentración de IBAK en 10 veces. En este medio permanecen en oscuridad dentro de la cámara de cultivo tras el cual, se transfieren a medio básico, donde permanecen hasta que se desarrollen las raices.

Una vez desarrolladas las raices, las plántulas se transfieron a un sustrato compuesto de turba y perlita en bandeja de alveolos dentro de túnel de plástico (Figura 5), realizando una aclimatación progresiva en invernadero. Esta aclimatación consistió en mantener el tunel cerrado durante 7 días, y realizar posteriormente una apertura progresiva del mismo desde 15 minutos al día y aumentando el periodo de apertura en 15 minutos cada día hasta llegar a las 3 horas, momento en el cual el túnel se abrió definitivamente. Las plantas una vez aclimatadas se pasan a cajoneras (Figura 5) donde se recogerá el material vegetal para injertar y crear las plantas que formarán la nueva colección.

 

Resultados y discusión

Detección del fitoplasma causante del decaimiento del peral

El primer testado general de la presencia del fitoplasma con los cebadores PCR en la colección de germoplasma de peral del CITA se emprendió durante el período vegetativo del año 2000, detectándose el fitoplasma en alguna de las 3 repeticiones de 19 variedades diferentes de 142 testadas, lo que supuso un 13% de las variedades afectadas.

En el año 2004, el número de variedades afectadas por el fitoplasma había aumentado hasta 58, lo que suponía un 41% de la colección, aunque muchas variedades, no mostraban síntoma alguno de la enfermedad. En la primavera de 2005 se procedió al injertado en vivero de 84 variedades negativas para el diagnostico mediante las técnicas de PCR descritas en ERREA et al., (2002) y se intensificó el saneamiento de la colección mediante técnicas de cultivo in vitro. Un dato que indica la rápida extensión del fitoplasma en la colección fue su aparición en 27 de estas variedades injertadas durante el testado rutinario del otoño del 2005. Esto supone que durante período vegetativo del 2004, el incremento de la infección en la colección aumentó en un 19%, confirmando las preocupantes observaciones de SPAAR et al., (1972), sobre el corto plazo que necesita el fitoplasma para extenderse en una parcela con diversos focos de infección y producir la mortalidad de mas del 25% de la plantación en el octavo año desde la primera infección.

Esta rápida extensión del fitoplasma en la colección se ve favorecida por los ataques del vector Cacopsylla pyri, de difícil control por la complejidad en determinar los momentos mas adecuados para las aplicaciones foliares de los tratamientos insecticidas, y la falta de efectividad de los mismos por las variaciones fenotípicas existentes en las colecciones de germoplasma de las distintas especies frutales, como por ejemplo, la variabilidad en la época de floración y maduración. La lucha química en una colección contra los insectos psílidos del género Cacopsylla vectores de virus y fitoplasmas, tiene que ser necesariamente mucho más intensa que en una plantación comercial, para evitar lo más posible la extensión de la infección hasta el arranque de la misma sea posible, cuando se haya completado el saneamiento de las variedades y la nueva colección sea operativa.

La elevada transmisión por el injerto sufrida, estaría causada principalmente por el tipo de injerto utilizado para esta ocasión. El "injerto omega de taller", presenta muchas virtudes, ya que resulta muy cómodo y rápido de realizar y muestra un alto éxito en el prendimiento de las yemas. Sin embargo, es el tipo de injerto que supone una mayor transferencia de tejido lignificado de la planta original, injertando una porción de ramo con unas 5 yemas vegetativas (Figura 2). Ello implica que si la planta donante esta infectada por un virus o fitoplasma, la transmisión del mismo por el injerto es prácticamente inevitable.

Finalmente, aunque el porcentaje de la colección que fue necesario sanear in vitro fue alto, sobre un 60%, el diagnóstico de la presencia del fitoplasma basado en la amplificación de parte de su genoma por medio de técnicas de PCR, ha permitido una temprana y precisa identificación de las plantas enfermas permitiendo su saneamiento cuando muchas de ellas no mostraban síntomas o estos no eran preocupantes, evitando la pérdida de alguna variedad.

 

Obtención de material vegetal libre del fitoplasma causante del decaimiento del peral

La técnica de cultivo in vitro de brotes con crecimiento activo cogidos en primavera, abril y comienzo de mayo, de plantas con el fitoplasma causante del decaimiento del peral, ha permitido regenerar plantas enteras libres de fitoplasmas (Figura 5), tal como habían indicado previamente ERREA et al., (2002) y HORMAZA et al., (2002).

El hecho de que los ápices tomados al inicio de la primavera no hayan desarrollado plantas con la presencia del fitoplasma, probablemente no se debe a que la parte aérea de la planta quede mas o menos libre de fitoplasmas durante el invierno, sino, más bien, porque, tanto en las yemas, como los ápices que inician su crecimiento activo no se encuentran todavía colonizadas por el patógeno, ya que son tejidos de rápido crecimiento sin lignificar. Otro factor que sin duda beneficia al saneamiento, es que durante los repetidos procesos de repicado del material en proliferación, se toman los brotes mas vigorosos y que han experimentado un crecimiento más rápido, y por lo tanto de mas difícil colonización.

En el caso extremo de existir fitoplasmas en los brotes recogidos del campo, el crecimiento de los brotes, superaría a la expansión del fitoplasma, por lo que tomando siempre las zonas apicales de los brotes generados in vitro obtenemos material vegetal libre de fitoplasmas. Estos resultados demuestran que la técnica de cultivo in vitro de ápices como método de saneamiento para estos fitoplasmas es, al igual que para muchos virus, una técnica viable que no necesita de la combinación de otras técnicas usadas habitualmente en frutales, como son la aplicación de la termoterapia, siempre que se tenga en cuenta la época de recogida de la yema, siendo la más favorable la entrada de la planta en crecimiento activo, al inicio de la primavera.

En la actualidad, se ha concluido el saneamiento en dos terceras partes de las variedades infectadas, mientras que el otro tercio se encuentra en estados avanzados del saneamiento y en ningún caso se ha encontrado la presencia del fitoplasma en las plantas procedentes del cultivo in vitro.

Por otra parte, se ha observado grandes diferencias en el comportamiento entre variedades durante las distintas etapas del cultivo in vitro, de manera que en algunas variedades fue necesario el establecimiento in vitro sólo una vez, obteniendo fácilmente gran número de plantas aclimatadas después de la etapa in vitro y en otras variedades, los tres procesos de proliferación, enraizado y climatización resultaron sumamente costosos. Probablemente, este comportamiento diferencial entre variedades sea intrínseco de cada genotipo y no depende del grado de afección de la enfermedad en la planta.

 

Conclusiones

Debido a que los tratamientos contra la proliferación de los insectos del género Cacopsylla en una colección de germoplama no son tan efectivos como en una plantación comercial y que la destrucción de las variedades enfermas no se realiza hasta que se han recuperado mediante su saneamiento efectivo, resulta extremadamente complejo evitar la extensión de las enfermedades causadas por virus o fitoplasmas, como es el caso del decaimiento del peral.

No obstante, el diagnóstico de la presencia del fitoplasma causante del decaimiento del peral mediante técnicas de PCR, ha permitido identificar eficazmente las variedades infectadas antes que mostraran síntomas evidentes de la enfermedad, permitiendo un saneamiento más precoz y preciso de la colección, evitando la pérdida de alguna variedad.

La efectividad de esta técnica de detección del patógeno la hace fiable para garantizar la sanidad del material vegetal empleado y tener un control mas seguro de la enfermedad y de esta manera evitar su propagación.

La técnica de cultivo in vitro de ápices como método de saneamiento para estos fitoplasmas ha resultado muy efectiva sin necesidad de aplicar otras medidas como la termoterapia, siempre que se tenga en cuenta la época de recogida de los brotes, siendo la más favorable, el comienzo del crecimiento activo de la planta, al inicio de la primavera.

Como se puede desprender de este trabajo, la regeneración de un material vegetal sano para la renovación de cualquier colección de germoplasma, implica un gran esfuerzo económico para los centros que están al cargo de estas colecciones y una alta implicación de su personal, debido a la necesidad de la aplicación de técnicas biotecnológicas de diagnóstico y de saneamiento en un elevado volumen de material de una forma rutinaria.

Ante la fragilidad de las colecciones de germoplasma frente a las distintas enfermedades y gran esfuerzo que supone su saneamiento, sería muy conveniente la creación de un reservorio de material vegetal sano para cada especie frutal, mantenido en condiciones de cuarentena, y que estuviese a disposición de los distintos centros que poseen colecciones de germoplasma. Ello permitiría poder realizar una rápida renovación de las variedades en el caso que se detectara una infección y evitar su extensión dentro de las colecciones.

 

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