28as jornadas de productos fitosanitarios
El desarrollo de resistencias a los fungicidas por parte de muchos patógenos, conjuntamente con un creciente interés social sobre los riesgos medioambientales y para la salud que tienen estos pesticidas, han generado un gran interés en el desarrollo de métodos alternativos a los productos químicos de síntesis. El Control Biológico de las enfermedades de poscosecha en fruta de pepita se ha mostrado como una de las alternativas más prometedoras al control químico. El esfuerzo que la investigación dedica a ésta área se ha incrementado de manera espectacular, y se refleja por la existencia de un elevado número de patentes. Entre las patentes se encuentra la patente de la cepa CPA-1 de la levadura Candida sake aislada de la superficie de manzanas y desarrollada en su totalidad por la unidad de patología del área de postcosecha del Centro UdL-IRTA. Esta cepa ha demostrado tener gran actividad antagónica contra los principales patógenos de fruta de pepita y ya se han finalizado las etapas de producción y formulación, pasos claves que nos permiten optimizar la eficacia, seguridad , facilidad en la aplicación y estabilidad con el fin de utilizarlos comercialmente como alternativa a los fungicidas químicos.
Las frutas son un grupo de alimentos fundamentales en la dieta humana porque aportan sustancias nutritivas esenciales como son vitaminas y minerales. Así mismo, contienen antioxidantes y fibra que son considerados importantes para la salud humana. Pero la fruta, al ser un producto perecedero, precisa de una tecnología lo más adecuada posible para su conservación, preservándose en el tiempo sus características organolépticas, así como su apariencia en términos de frescura, color y tersura, por lo que se precisan estrategias para la protección cuali-cuantitativa de los frutos, ante la necesidad de poder distribuir en el tiempo un producto perecedero.
La sociedad actual demanda productos de alta calidad con buen aspecto físico y estado sanitario adecuado y por lo tanto libre de alteraciones fúngicas y de residuos químicos. Los mohos, son los principales agentes causantes de podredumbres en la fruta conservada en cámara frigorífica. Los fungicidas químicos son el sistema más usado para el control de las podredumbres fúngicas. Sin embargo, su utilización masiva ha provocado la aparición de cepas patógenas resistentes, disminuyendo así la eficacia de los mismos y provocando además un incremento de residuos en la fruta. El creciente interés social sobre la salud y peligros medioambientales ha llevado a la búsqueda de alternativas a los productos químicos de síntesis.
La reducción del inoculo fúngico en la central Hortofrutícola a través de una buena limpieza y desinfección, las técnicas de conservación y manejo que minimicen el daño a la fruta y la utilización de condiciones de almacenamiento óptimas para mantener la resistencia del huésped, junto con un control biológico pueden resolver de forma muy satisfactoria el riesgo a causa de las enfermedades fúngicas en poscosecha de frutas y la presencia de residuos químicos.
El término Control Biológico o Biocontrol de enfermedades ha experimentado desde el comienzo de su utilización cambios en cuanto a su contenido y definición, siendo la más aceptada actualmente la indicada por Baker (BAKER, 1987) que define al Control Biológico como "la reducción del inoculo o de la actividad productora de enfermedad del patógeno, debido a uno o más organismos, incluida la planta huésped y excluido el hombre". De esta definición se desprenden un gran número de posibles vías a explorar en la búsqueda del control de las enfermedades de postcosecha de frutas. Estas son: 1. Uso de microorganismos antagónicos. 2. Uso de fungicidas naturales derivados de metabolitos de la planta. 3. Manipulación de la resistencia en productos recolectados.
Microorganismos antagónicos como agentes de biocontrol en postcosecha
Para controlar las enfermedades de postcosecha mediante la utilización de microorganismos antagónicos existen dos posibles vías. Podemos estimular y manejar antagonistas que ya existen sobre la superficie del fruto o bien podemos introducir artificialmente antagonistas contra los patógenos.
Existen tres factores por los que la utilización de antagonistas introducidos artificialmente en el ambiente de postcosecha puede constituir un área excepcionalmente productiva. Primero, una de las principales razones del fracaso de los agentes de biocontrol en el pasado ha sido la incapacidad para controlar las condiciones ambientales, por lo que bajo las condiciones de almacenamiento de los productos recolectados, las condiciones ambientales están controladas.
Segundo, es a menudo difícil dirigir los agentes de biocontrol hacia los lugares efectivos, mientras que los productos recolectados no presentan este problema ya que las áreas de aplicación de los agentes de biocontrol son más limitadas de lo que puedan ser las plantas completas, por lo que se hace más fácil dirigir tales agentes. Tercero, el alto valor que pueden tener los productos recolectados justifica la aplicación con los agentes de biocontrol, aunque su coste sea superior a los procedimientos habituales.
Todo antagonista en potencia para ser eficaz contra hongos de postcosecha ha de tener pues la habilidad de colonizar y persistir con comodidad a niveles efectivos, ser compatible con otras prácticas, procesos y productos químicos de postcosecha y ser efectivo a bajas temperaturas y en algunos casos en condiciones de atmósfera controlada. La producción y formulación de los agentes de biocontrol son puntos clave en el desarrollo de los mismos, ya que nos permite optimizar su rendimiento y estabilidad, con el fin de utilizarlos comercialmente como sustitutos de los productos químicos de síntesis.
Un aspecto muy importante en la comercialización de los agentes de biocontrol es la aceptación por parte de la sociedad de la aplicación de microorganismos "vivos" en los alimentos. Esta idea no es nueva, ya que desde tiempos muy antiguos, las fermentaciones mediante microorganismos han sido un método importante para preservar los alimentos. La adición de microorganismos en la preparación del pan y en productos derivados de la leche ha sido ampliamente aceptada. Por esto parece que la sociedad aceptaría los antagonistas microbianos si estos llegasen a ser una alternativa segura y efectiva a los fungicidas sintéticos.
Situación actual del control biológico en postcosecha de frutas de pepita
Hay muchos ejemplos de solicitudes de patentes de microorganismos para el control de enfermedades de postcosecha, la mayoría en los EE UU: Pseudomonas cepacia, P. syringae, Acremonium breve, Pichia guilliermondii, Debaryomyces hansenii y Candida oleophila. En Europa cabe destacar la patente de Candida sake en el control de Botrytis cinerea, Rhizopus nigricans y Penicillium expansum en manzanas y peras (VIÑAS et al., 1998) .
En el caso de los EE UU ya existe una normativa específica de registro de los agentes de biocontrol, que consiste en una serie de niveles de estudios toxicológicos, cada vez más costosos y largos en su realización. Si el agente de biocontrol supera con éxito el primer nivel que es el de menor toxicología, ya se acepta y no requiere la realización de estudios toxicológicos más costosos y de mayor tiempo de realización. Esta gran diferencia de costos y tiempo es principalmente debida al gran interés por parte de la EAP (Agencia de Protección Medio-ambiental) de los EE UU, en facilitar la aparición de pesticidas biológicos.
Este hecho ha comportado que ha principios de 1996 aparecieron tres productos biológicos en el control de las enfermedades de postcosecha de fruta, Bio-save 100, 110 y 1000, formulados con la bacteria Pseudomonas syringae, comercializados por la empresa EcoScience y Aspire con la levadura Candida oleophila y comercializado por Ecogen Inc. Cabe indicar que estos productos de agentes de biocontrol de las enfermedades de postcosecha de fruta ya han aparecido en el mercado de los EE UU y se están utilizando desde 1997 fundamentalmente en producción orgánica.
Proceso de desarrollo de un agente de biocontrol
Para que un microorganismo se convierta en un agente de biocontrol y pueda comercializarse, es imprescindible la colaboración entre los investigadores y las empresas del sector fitosanitario para realizar todas las etapas necesarias que integran un programa de control biológico. Para llevar a cabo un programa de control biológico las etapas a cubrir son las siguientes:
- Aislamiento e identificación del agente de biocontrol.
- Realización de los ensayos de eficacia.
- Realización de los ensayos de seguridad, tanto para el hombre como para el ambiente y para los organismos que no ha de controlar.
- Estudio de la estabilidad genética del agente de biocontrol.
- Estudio de su potencial para la producción en masa.
- Formulación del agente de biocontrol.
- Realización de ensayos de estabilidad y de caducidad del producto.
- Estudio del mercado potencial
- Evaluación de los costes del producto.
- Realización de análisis de inversiones.
- Realización de ensayos a nivel comercial.
- Patente del agente de biocontrol.
- Registro del agente de biocontrol.
- Comercialización y venta del pesticida biológico a los usuarios.
Desarrollo, producción y formulación comercial de la cepa CPA-1 de Candida sake
Desde 1989 investigadores del laboratorio de Patología del Área de Postcosecha del Centro UdL-IRTA de Lleida estamos estudiando nuevos métodos alternativos de control de las enfermedades fúngicas de postcosecha, centrándonos en el estudio del control biológico mediante microorganismos antagonistas.
Entre 1990-1995 se aislaron más de 1.000 microorganismos procedentes de la superficie de manzanas, peras y hojas de frutales de la zona de Lleida.
Estas cepas se ensayaron para determinar su capacidad de control frente al Penicillium expansum , el principal agente causal de podredumbres en fruta de pepita. Más del 40% de los microorganismos ensayados mostraron una cierta capacidad antagónica (>15% de reducción de la podredumbre), pero solamente el 9,8% redujeron el nivel de podredumbre por encima del 50%.
Después de realizar y evaluar los resultados de un ensayo de efectividad a mayor escala que el anterior, se seleccionaron 4 microorganismos como potenciales agentes de biocontrol, para determinar posteriormente su capacidad inhibidora a temperatura de frigoconservación y a diferentes relaciones O2 /CO2
La cepa que mostró mayor capacidad inhibidora, fue identificada como C. sake (Saito & Ota Van Uden & Buckley). Esta levadura procede de la superficie de manzanas. Está concedida la patente a nivel del estado español y a nivel internacional en 12 países. La especie Candida sake es un microorganismo epifítico de diversos materiales vegetales (manzanas, uvas, tomates, etc.) y no se encuentra asociada a animales de sangre caliente. Además es destruida por temperaturas de 37ºC (temperatura corporal humana). La LD50 es superior a 1,7x1010 ufc/Kg, en rats Wistar, según los estudios toxicológicos realizados en el Centro de Investigación Desarrollo Aplicado (SAL) de Barcelona. La empresa de agroquímicos SIPCAM INAGRA SA, es detentora de los derechos de explotación de la cepa.
La cepa de C. sake muestra una gran capacidad inhibidora del desarrollo de las principales enfermedades de postcosecha tanto en manzanas como en peras.
Su efectividad ha estado ampliamente demostrada a nivel de laboratorio, tanto a 20ºC como en condiciones de refrigeración en fruta con heridas e inoculada (VIÑAS y cols, 1998) como a nivel semicomercial en condiciones de refrigeración y de atmósfera controlada (USALL y cols, 2000).
La cepa de C. sake en ensayos de laboratorio a 20ºC de temperatura de incubación, inhibe el desarrollo de las podredumbres causadas por Botrytis cinerea, Penicillium expansum y Rhizopus nigricans. Ninguna lesión se desarrolla en el fruto tratado a las tres concentraciones ensayadas del antagonista (7,5 x 105, 1,6 x 106 y 2,4 x 106 ufc/ ml) y a 103 o 104 conidios/ml de B.cinerea . (Tabla 1). A
105 conidios/ml de B.cinerea, se alcanza el control total a las dos concentraciones más altas de antagonista. C. sake reduce o completamente controla el desarrollo de la podredumbre sobre fruta con heridas e inoculada con P. expansum o R. nigricans (Tabla 2 y 3). Cuando las concentraciones de antagonista se incrementan también se incrementa el control del patógeno. Ninguna lesión se desarrolla sobre las manzanas inoculadas con C. sake a 1,6 x 106 y 2,4 x 106 ufc/ml y a 103 conidios/ml de los patógenos P. expansum o R. nigricans. Usando la dosis de 1,6 x 10 6 ufc/ ml del antagonista se consigue una reducción de la infección por R. nigricans del 97% a las concentraciones de patógeno de 104 o 105 conidios/ml. En condiciones de almacenamiento en frío (1ºC) durante 60 días, seguidos de 7 días de 25ºC, simulando la vida de estantería, y en ensayos con una unidad de muestra de 20 frutos, con tres repeticiones en manzanas Golden Delicious a la concentración de C. sake a 1,6 x 10 6 ufc/ ml y de los patógenos P. expansum y B.cinerea de 10 4 conidios/ml se consiguen reducciones de la lesión del 91,7% y 92,3% respectivamente. El control permanece superior al 75% durante la vida de estantería en ambos mohos ensayados.
Respecto a la dinámica poblacional de C. sake CPA-1 en diferentes condiciones comerciales de almacenamiento en frío (1% de O2 ? 1% C O2; 3% de O2? 3% C O2; 3% de O2 ? 6 % C O2) sobre la superficie de manzanas, se observa que durante las dos primeras semanas la población disminuye de 4 a 10 veces respecto a la concentración inicial. A los 45 días la población se incrementa hasta alcanzar aproximadamente la población inicial, alcanzándose el nivel más alto en la condición de 1% de O2 ? 1% C O2 y la más baja en 3% de O2 ? 3% C O2. A partir de este día la población se mantiene estable hasta el último día de muestreo que fue a los 90 días (Figura 1). Este ensayo demuestra la capacidad de C. sake CPA-1 de colonizar la superficie de manzanas bajo diferentes condiciones de almacenamiento. Esta habilidad fue siempre mayor en heridas que en la superficie no dañada (Foto 1)
Esta cepa de levadura está muy adaptada a las bajas temperaturas y a las condiciones de atmósferas modificadas que son las habituales en las Centrales Hortofrutícolas. Obteniéndose en estas condiciones, óptimos resultados en el control de un gran número de hongos patógenos causales de podredumbres en diversas variedades de fruta en postcosecha. En un ensayo de laboratorio en diferentes condiciones comerciales de almacenamiento en frío (21% O2 ; 3% de O2 ? 3% C O2 ; 1% de O2 ? 1% C O2 ) en manzanas Golden Delicious con una unidad de muestra de 20 frutos, con tres repeticiones y con heridas e inoculadas las frutas a las concentraciones de C. sake de 7,5 x 105 , 1,6 x 106 y 2,4 x 106 ufc/ ml y a 10 4 conidios/ml del patógeno P. expansum . Se observó que C. sake fue muy efectiva en el control de las lesiones producidas por P. expansum.
En las condiciones de almacenamiento de 3% de O2 ? 3% C O2 el antagonista mostró la máxima capacidad de control, obteniéndose niveles del 97% de reducción de la podredumbre a la concentración de C. sake de 2,4 x 106 ufc/ ml (Figura 2).
Durante diversas campañas se han realizado ensayos en condiciones comerciales que han demostrado que la cepa de C. sake CPA-1 presenta el mismo nivel de control que el fungicida de síntesis imazalil y es más efectiva que la mezcla tiabenzazol y folpet a las dosis comerciales (USALL y cols, 2001). (Figura 3)
Nuestro grupo de investigación ya ha finalizado los estudios de producción y formulación de C. sake. En la optimización de los medios de producción y fijación de los principales parámetros de crecimiento de C. sake se ha conseguido poner a punto un medio de cultivo económico y de alto rendimiento. En lo que respecta a la formulación, se ha conseguido un producto formulado que provee las condiciones necesarias para mantener la viabilidad del microorganismo durante la preparación, almacenamiento y aplicación, y favorece la supervivencia de C. sake en el ambiente de frigoconservación donde debe actuar, así mismo propicia que se recuperen rápidamente los procesos metabólicos del microorganismo una vez se ha aplicado.
Con este producto formulado de C. sake se han realizado ensayos de efectividad en condiciones de laboratorio (Foto 2) y en ensayos comerciales. Destacar las aplicaciones prácticas comerciales realizadas durante varias campañas con manzanas y peras en Lleida, en Lanxade (Francia) y en Boloña (Italia) aplicando una concentración de 107 ufc/ml (en España y Francia) y de 5x 107 ufc/ml (en Italia) del agente de biocontrol mediante "drencher" a la fruta recién recolectada. Después de 5-7 meses de conservación en atmósfera controlada, se observó que la fruta tratada con C. sake mostraba una gran capacidad de control de las principales enfermedades de postcosecha. Los niveles de podredumbre de los tratamientos fueron estadísticamente inferiores a los observados con la fruta sin ningún tratamiento e iguales a las frutas tratadas son productos químicos de síntesis habituales. (TORRES y cols, 2006).
En la actualidad el agente de biocontrol se encuentra en los pasos previos al registro del microorganismo, que son necesarios para su futura comercialización.
Por lo que podemos concluir que el control de las enfermedades en postcosecha de fruta de pepita mediante la utilización de la cepa CPA-1 de C. sake será una alternativa eficaz y viable.
Muchos analistas sobre industrias y negocios de pesticidas están de acuerdo en afirmar que la transición desde el control químico al biológico es inevitable.
Los dos principales factores que determinan que sea o no factible la utilización de un determinado agente de biocontrol son su fiabilidad y la rentabilidad económica.
BIBLIOGRAFÍA
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TORRES, R. , TEIXIDO, N. , VIÑAS, I., MARI, M., CASALINI, L.,GIRAUD, M., USALL, J. 2006. Efficacy of Candida sake CPA-1 formulation for controlling Penicillium expansum decay on pome fruit from different mediterranean regions. Journal of Food Protection (en prensa)
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USALL, J., TEIXIDO, N., TORRES, R., X.OCHOA DE ERIBE., VIÑAS, I. 2001. Pilot tests of Candida sake (CPA-1) applications to control postharvest blue mold on apple fruit. Postharvest Biology and Technology 21: 147-156
VIÑAS, I., USALL, J., TEIXIDO, N., SANCHIS, V. 1997. Nueva cepa de Candida sake (Saito &Ota) van uden and Buckley y su utilización como agente de control biológico de las enfermedades fúngicas de postcosecha de frutas. Patente española P2089981. Oficina Española de Patentes y Marcas.
VIÑAS, I.; USALL, J.; TEIXIDO, N.; SANCHIS, V. (1998). Biological control of major postharvest pathogens on apple with Candida sake. International Journal of Food Microbiology, 40: 9-16.
