28as jornadas de productos fitosanitarios
Este capítulo trata sobre control biológico en la filosfera mediante la aplicación de biofungicidas, fungicidas cuya materia activa es un microorganismo antagonista. Considerando en
general bioplaguicidas (excluyendo los dirigidos a insectos plaga) actualmente hay unos 50 productos biológicos formulados en el mercado internacional que proceden mayoritariamente de USA e Israel y se aplican sobre todo en pulverización o a las semillas. Un 68% va dirigido a patógenos de suelo y sólo un 20% a enfermedades de partes aéreas. Esto es debido principalmente a que en la filosfera se desarrolla un ecosistema con graves limitaciones ambientales para el desarrollo de los microorganismos. No obstante existen numerosos ejemplos de control biológico en la filosfera. Aquí se describe un ejemplo del desarrollo de agente de biocontrol frente a una enfermedad aérea realizado en nuestro laboratorio. La aplicación de este biofungicida va dirigida al control de Monilinia spp. en fruta de hueso (postcosecha). Los hongos antagonistas son Penicillium frequentans Westling y Epicoccum nigrum Link y han sido aislados en nuestro laboratorio y actualmente se encuentran en fase de desarrollo comercial.
Concepto
Las enfermedades vegetales resultan de la interacción de un patógeno, con un huésped susceptible en un ambiente favorable. En este triángulo clásico de la enfermedad hay un cuarto factor que se tiene en cuenta al hablar de control biológico: los organismos antagonistas (Figura 1)
Así el control biológico incluye estrategias y métodos para controlar las enfermedades a través de la actividad de organismos vivos distintos del hombre.
No existe un acuerdo general sobre lo que se considera control biológico, habiendo definiciones más o menos amplias en las que se incluyen algunos tipos de control o no. La definición dada por Baker y Cook (1974) es una de las que consideramos más apropiada. Estos autores definen control biológico como "la reducción de la densidad de inóculo o de las actividades inductoras de enfermedad de un patógeno o un parásito, en estado activo o durmiente, por la acción de uno o más organismos". Lo que siempre queda claro en todas es que en el control biológico interviene un tercer elemento vivo (junto con el huésped y el patógeno), que es el antagonista. En el caso del control microbiano este elemento vivo es un microorganismo.
Los componentes del control biológico son cuatro: patógeno, antagonista, ambiente y huésped. El control del patógeno se puede aplicar en cualquier parte de su ciclo de vida existiendo diversas estrategias de control, basadas en la epidemiología de la enfermedad, que pueden ir dirigidas bien a la eliminación ó a la reducción del inóculo inicial o bien a la disminución del desarrollo de la enfermedad. Estas estrategias serán más o menos eficaces dependiendo del tipo de patógeno al que nos enfrentemos, monocíclico o policíclico, aspectos como su naturaleza biótrofa o necrótrofa, su accesibilidad al antagonista, etc... Un mejor conocimiento de la biología y epidemiología del patógeno al que va dirigido el control hará que éste sea siempre más eficaz. Todos los principios y toda la ciencia que se aplica para otros métodos de control más desarrollados, como el control químico, son también de aplicación para el control biológico.
Un antagonista definido en sentido amplio es un oponente o un adversario.
En términos de control biológico los antagonistas son agentes biológicos con potencial para interferir en cualquiera de los procesos vitales de los patógenos vegetales (CAMPBELL, 1989). Los antagonistas pueden ser todo tipo de organismos: hongos, bacterias, nematodos, protozoos, virus, viroides y plantas. El término es equivalente a los enemigos naturales utilizado en el caso de insectos plaga. El antagonismo es "toda acción directa o indirecta ejercida por microorganismos que resulta en la reducción de la expresión de enfermedad". La explotación del antagonismo por el hombre consiste en una modificación cuidadosa del equilibro biocenótico para el beneficio de la planta cultivada. Un microorganismo antagonista puede presentar cinco modos de acción frente a un patógeno: competencia, antibiosis, explotación, resistencia inducida en el huésped y lisis, bien de forma individual o asociada.
La planta huésped es un participante en todos los sistemas de control biológico dirigidos a la supresión de las actividades inductoras de enfermedad de los patógenos, así como en muchos casos de control biológico dirigido a regular la cantidad de inóculo de éste. Puede actuar directamente suprimiendo la patogénesis o la reproducción del patógeno por mecanismos de resistencia ó indirectamente al proporcionar el punto de acción de uno o más antagonistas.
Finalmente, el ambiente es un factor crucial en el éxito del control biológico. Incluye temperatura, potencial hídrico, radiación, pH, cargas superficiales, presión parcial de gases, iones y elementos y compuestos de carbono que contienen energía. Cada uno de estos factores varía en tiempo y en espacio e interacciona entre ellos. El ambiente abiótico es dinámico, heterogéneo y complejo.
Su medida y conocimiento son difíciles especialmente en la filosfera y sigue siendo un gran reto para el control biológico y en general para la Patología Vegetal
Desde hace tiempo se está dedicando gran esfuerzo al desarrollo del control biológico, probablemente debido a la frustración de no poder utilizar otras técnicas de control de enfermedades y a la creencia de que es menos perjudicial para el medio ambiente que la utilización de técnicas físicas y químicas. El creciente interés que este tipo de control ha suscitado queda reflejado en la explosión de publicaciones científicas, libros y simposios a los que ha dado lugar.
Sin embargo su aplicación práctica se encuentra en su infancia dándose pocas aplicaciones a nivel agricultor, sobre todo si se compara con el control químico.
Varias son las razones que contribuyen a su bajo desarrollo comercial.
Los esfuerzos y el interés de las compañías en los productos biológicos han sido pequeños hasta el momento debido a que los resultados obtenidos no son tan reproducibles ni tan eficaces como con los productos químicos, Un problema adicional al que se enfrentan ahora las compañías interesadas en estos productos es que su registro en Europa se rige por la misma directiva (Directiva CEE 91/414) que los productos químicos lo que hace que los gastos de registro de estos productos sean también muy elevados.
Aplicación
De la propia definición de control biológico se desprende que éste se puede aplicar de tres formas (COOK Y BAKER, 1983), aunque en la práctica suelen solaparse:
1. Explotación del control biológico natural. Se da en situaciones en las que la enfermedad no es grave e incluso está ausente y una de las causas es la actuación de un control biológico natural. Este tipo de biocontrol no se ha estudiado en profundidad, desconociéndose hasta que punto puede ser importante en situaciones de ausencia o poca gravedad de la enfermedad. Los estudios en Patología Vegetal se han centrado en el estudio de la enfermedad y de epidemias importantes, puesto que son esas las situaciones que crean problemas económicos. El control biológico natural puede estar operando donde un patógeno causa poca o ninguna enfermedad en un ambiente aparentemente favorable o donde un patógeno no es capaz de establecerse a pesar de su frecuente introducción en un área aparentemente favorable. El hombre puede explotar el control biológico natural identificando los agentes que mantienen las poblaciones de los patógenos a niveles tolerables de forma natural y, una vez identificadas, preservar o mejorar las condiciones que hacen que se obtenga el control. En algunos casos estas prácticas pueden consistir en evitar el uso de productos químicos que destruyen la población de antagonistas que controlan al patógeno. Un ejemplo importante de control biológico natural en la filosfera es el de Cryphonectria parasitica (Murril) Barr.
2. Modificación del ambiente. El ambiente se modifica para favorecer la actividad de los antagonistas ya presentes en él. Se han utilizado muchas técnicas para modificar el ambiente y conseguir controlar enfermedades pero sus mecanismos de acción son generalmente mal entendidos; la rotación de cultivos, la manipulación del ambiente físico del suelo, de cultivos protegidos y de cámaras en postcosecha (humedad, temperatura, aireación), la utilización de productos químicos, y la adición de enmiendas orgánicas son técnicas que se utilizan habitualmente con mayor o menor éxito.
3. Introducción de antagonistas. Cuando los patógenos no son inhibidos por los antagonistas naturales se puede conseguir un control biológico aumentando la cantidad de éstos mediante su introducción en el ecosistema. Este es el sistema que más se utiliza en control biológico aunque como ya se ha comentado anteriormente son muchos los casos que no han llegado a la práctica. Los antagonistas pueden ser identificados más o menos fácilmente en laboratorio pero la mayoría fallan al aplicarlos en condiciones naturales, bien por su incapacidad para sobrevivir en ese medio o porque el mecanismo de antagonismo sea poco eficaz o resulte inhibido en esas condiciones. Incluso en el caso de que el antagonismo tenga lugar, el antagonista debe persistir en el medio durante todo el tiempo necesario para suprimir la enfermedad, lo que no ocurre a menos que esté bien adaptado al microambiente del patógeno. Estas consideraciones de falta de control en condiciones prácticas han hecho que se haya variado en los últimos años la estrategia de selección de antagonistas.
Antes se seleccionaban gran número de antagonistas con ensayos in vitro de laboratorio y luego se veía si funcionaban en campo. Ahora los ensayos se realizan en las condiciones más parecidas a las reales que permitan una garantía de éxito. Las investigaciones se han centrado también más en el estudio de la ecología de los antagonistas y su relación con la epidemiología de los patógenos. El mayor conocimiento del modo de acción de los antagonistas también permite un mejor diseño de su aplicación en el biocontrol.
La introducción de agentes de biocontrol está basada en el desarrollo de biofungicidas o productos biológicos con acción fungicida, en el caso del control de hongos fitopatógenos que es el que nos ocupa. Los biofungicidas son fungicidas cuya materia activa es un microorganismo antagonista. Considerando en general bioplaguicidas (excluyendo los dirigidos a insectos plaga) actualmente hay unos 50 productos biológicos formulados en el mercado internacional que proceden mayoritariamente de USA e Israel y se aplican sobre todo en pulverización o a las semillas. La materia activa de la mayoría de estos productos es un hongo o una bacteria, aunque hay algunos que contienen levaduras.
Un 68% actúan por competencia y antibiosis, 15% solo por competencia; 8% por competencia, antibiosis y lisis y 5% por hiperparasitismo, aunque algunos incluyen la resistencia inducida y la promoción del crecimiento en sus mecanismos de acción. Un 68% va dirigido a patógenos de suelo (Rhizoctonia solani, Kühn, Pyhtium spp., Phytophthora spp., Fusarium spp., Sclerotium spp., Verticillium spp., Agrobacterium tumefaciens (Smith & Townsend) Com) y sólo un 20% a enfermedades de partes aéreas (antracnosis oidio, mildiu, Cercospora spp, Heterobasidium annosum (Fr.) Bref., Botrytis cinerea Pers., Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) Sacc.) y el resto a enfermedades de postcosecha (Penicillium spp, B. cinerea, Geotrichum candidum Link:Fr., Mucor pyriformis Fischer). En la Unión Europea están incluídas en el Anejo 1 de la Directiva CEE 91/414 solamente cuatro materias activas: Paecilomyces fumosoroseus (Apopka strain 97, PFR 97 or CG 170ATCC20874, 2001/47/EC), Coniothyrium minitans (Strain CON/M/91-08. DSM 9660. CIPAC No 614. 2003/79/EC), Pseudomonas chlororaphis (Strain: MA 342. CIPAC No 574.2004/71/EC), y Gliocladium catenulatum (Strain: J1446. Culture collection N° DSM 9212. 2005/2/EC). En España hay cuatro materias activas registradas, Coniothyrium minitans, Streptomyces griseovirides, Trichoderma harzianum y Verticillium lecanii (htpp\\www:mapya.es), y dos formulaciones, CONTANS WG y MYCOSPTOP (nº 19.837). El MYCOSTOP, lo fabrica KEMIRA AGRO OY (Finlandia) y lo comercializa VERDERA OY, es un polvo mojable cuya materia activa es S. griseoviridis, que actúa por competencia y antibiosis y es activo frente a algunas fusariosis en sandía, melón, pepino y arbustos ornamentales en semilleros y viveros.
El CONTANS WG, lo fabrica PROPHYTA BIOLOGISCHER PFLANSCHUTZ GMBH (Alemania) y lo comercializa AGRICHEM S.A., es un granulado dispersable en agua (WG), activo frente a Sclerotinia en suelos agrícolas.
Como ya se ha comentado anteriormente los productos biológicos para ser incluidos en el Anejo 1 del Registro Europeo de Productos Fitosanitarios tienen que cumplir unos criterios de evaluación que están descritos en la Directiva CEE 91/414. Estos criterios están basados en unos Principios Generales (eficacia y riesgos) y en unos Principios Específicos (identidad y propiedades biológicas, modo de acción, eficacia y especificidad, e impacto sobre el hombre y el medio ambiente). Todo esto conlleva una serie de estudios previos a la comercialización de un agente de biocontrol que quedan reflejados en la Tabla 1.
Tal y como se ha descrito anteriormente, la mayoría de los biofungicidas presentes en el mercado nacional y europeo se dirigen al control de enfermedades de suelo. Esto es debido principalmente a que en la filosfera se desarrolla un ecosistema con graves limitaciones ambientales para el desarrollo de los microorganismos. No obstante existen numerosos ejemplos de control biológico en la filosfera. A continuación ilustraremos el desarrollo de agente de biocontrol frente a una enfermedad aérea desarrollado en nuestro laboratorio. La aplicación de este biofungicida va dirigida al control de Monilinia spp. en fruta de hueso (postcosecha). Los hongos antagonistas son Penicillium frequentans Westling y Epicoccum nigrum Link y han sido aislados en nuestro laboratorio y actualmente se encuentran en fase de desarrollo comercial.
Monilinia spp. causa marchitez de brotes, flores y podredumbre de frutos de hueso. Se realizó una búsqueda de antagonistas frente al patógeno entre la microflora epifita anual de los brotes de melocotonero tanto in vitro como in vivo (MELGAREJO et al., 1985). Se demostró el potencial de dos de los antagonistas seleccionados (P. frequentans y E. nigrum en el control biológico de Monilinia en huertos experimentales (MELGAREJO et al., 1986). Posteriormente se comprobó el potencial como agentes de biocontrol de Monilinia en huertos comerciales utilizando individualmente cada uno de los antagonistas o en combinación con diferentes fungicidas en una estrategia de control integrado (DE CAL et al., 1990; DE CAL Y MELGAREJO, 1992; MADRIGAL et al. 1994; PASCUAL et al., 1996). Paralelamente se llevaron a cabo estudios del modo de acción de los dos agentes de biocontrol. La competencia parecía ser uno de los modos de acción más importantes (DE CAL et al., 1990). En el caso de P. frequentans era necesario que en los brotes hubiera 105-6 conidias/gr brote para que haya control de la enfermedad (DE CAL et al., 1990). Ambos antagonistas producían antibióticos in vitro, aunque no se detectaron sobre la fruta (DE CAL et al., 1988; MADRIGAL et al., 1991). Además, M. laxa era capaz de metabolizar antibióticos producidos por los antagonistas (MADRIGAL et al., 1993). P. frequentans producía los antibióticos frecuentina y palitantina y E. nigrum la flavipina que inhibían a M. laxa e inducían la formación de su estroma (MELGAREJO et al., 1989; Madrigal y Melgarejo, 1995). La aplicación de fungicidas inhibidores de la síntesis de melanina junto con estos antagonistas sería una buena estrategia de control integrado porque P. frequentans causaba la autolisis de las hifas no melanizadas (DE CAL Y MELGAREJO, 1993; 1994). La flavipina producida por E. nigrum tenía varios modos de acción sobre M. laxa: cambio en la permeabilidad de sus membranas, la inhibición de la síntesis de ATP y de la síntesis de proteínas (MADRIGALY MELGAREJO, 1994). Se hicieron también estudios sobre la mejora del inóculo de E. nigrum y P. frequentans para mejorar su competencia ecológica (PASCUAL et al., 1996; 2000).
Se ha iniciado el periodo de desarrollo de P. frequentans y E. nigrum mediante un método de producción en masa de conidias de los agentes de biocontrol por fermentación sólida produciéndose en este caso 108-9 conidias/g sustrato (DE CAL et al., 2001, DE CAL et al., 2002a, DE CAL et al., 2002b, LARENA et al., 2004). Se ha probado la eficacia de estas conidias durante las campañas 2000-2001, 2001-2002 y 2002-2003 en 20 huertos de melocotonero y nectarino de la provincia de Lleida (España), de las provincias de Verona y Lodi (Italia) y de Balandrán (Francia) en aplicaciones de precosecha en floración y prerrecolección, obteniéndose control de la podredumbre de la fruta en postcosecha con los tratamientos biológicos solos y en los integrados con productos químicos (LARENA et al., 2005). Las conidias de P. frequentans y de E. nigrum secadas por lecho fluido mantenían un 100% de viabilidad durante 90-120 días sin necesidad de protectores, mejorando los resultados de estabilidad obtenidos mediante el secado por liofilización o atomización (GUIJARRO et al., 2006a, LARENA et al., 2003). Se han incluído estabilizantes en los formulados secos de P. frequentans y de E. nigrum que prolongan la viabilidad de las conidias durante al menos 1 año y mejoran su eficacia frente a la enfermedad (GUIJARRO et al., 2006b, LARENA et al. 2006). Finalmente se ha iniciado el estudio de adherentes para formular los agentes de biocontrol, así como el momento óptimo para incluirlos en el formulado y comprobar su efectividad, trabajo que se encuentra actualmente en marcha.
Agradecimientos: Estos trabajos han sido posibles gracias a la financiación recibida en los siguientes proyectos: QLK99-01065 (V Programa Marco de la UE), AGL2000-0067-P4-03 (Plan Nacional de I+D+I), RTA 01-0033 (Plan Nacional de Recursos y Tecnologías Agroalimentarias), AGL2002-04396- C02-01 (Plan Nacional de I+D+I), y RTA2005- 00077-CO1).
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