Sección: Entomología
El control de plagas en el área mediterránea requiere en muchos casos de la utilización de depredadores polífagos, muchos de los cuales realizan una digestión extra-oral seguida de ingestión de material licuado, lo cual dificulta la identificación de las especies ingeridas. A finales de los 90 aparecieron los primeros estudios de depredación basados en la detección de ADN de la presa dentro del digestivo del depredador. Estas técnicas han sido utilizadas en estudios de depredación en cultivos tan diversos como los hortícolas, frutales y cereales, y posteriormente también en estudios de parasitismo. Con estas herramientas ha sido posible identificar las presas ingeridas por un depredador determinado; conocer la eficacia de un depredador frente diferentes presas; analizar el papel de presas no-plaga en el mantenimiento de los depredadores polífagos; o establecer los porcentajes de parasitismo y la distribución de especies de parasitoides en un área determinada.
La alternativa mejor considerada hoy en día para la reducción del uso de insecticidas en la agricultura es la utilización del control integrado de plagas, basado en la aplicación del control biológico, es decir, la utilización de enemigos naturales. En muchos casos se trata de la utilización de otros insectos o ácaros para el control de las plagas que afectan a los cultivos. Entre estos enemigos naturales, los depredadores y muy especialmente los depredadores polífagos son ampliamente utilizados en programas de control biológico.
El estudio de la relación depredador- presa: antecedentes
Para llevar a cabo estudios de depredación que permitan por ejemplo, discernir el espectro real de presas de las que se puede alimentar un depredador polífago; o determinar el rango de depredadores que pueden alimentarse de una especie plaga determinada; o bien, conocer sobre que especies de presa se está alimentando en condiciones de campo, es decir sin alterar su hábitat ni su comportamiento, se han utilizado tradicionalmente métodos basados en la disección del estómago del depredador seguida de una identificación morfológica de los restos sólidos. Esto es en general muy difícil, o bien imposible en depredadores que realizan una digestión extra-oral previa y una posterior succión del contenido licuado de la presa. Este es el caso de muchos depredadores polífagos utilizados en programas de control integrado, como son por ejemplo, los heterópteros y las arañas (Figura 1). Debido a esto, es necesario utilizar técnicas moleculares que permitan una detección de la presa mucho más sensible.
Las técnicas moleculares que pueden utilizarse en este tipo de estudios pueden clasificarse en dos grandes grupos: las técnicas de detección proteica y las técnicas de detección de ADN. Por lo que se refiere a las primeras, podemos separar entre los métodos electroforéticos utilizados en estudios como los de Murray y Solomon (1978) en el cual se analizaba la dieta de diversos heterópteros antocóridos mediante el análisis de isoenzimas; y los métodos serológicos, basados en la reacción antígeno-anticuerpo.
Estos fueron los métodos habituales durante más de veinte años y se basaban en el desarrollo de anticuerpos policlonales o monoclonales (MAbs) y en la utilización de técnicas como el ELISA (Enzyme- Linked Immunosorbent Assay). Como ejemplos hay infinidad de estudios citados en las revisiones que Greenstone (1996) y Hagler y Naranjo (1996) hacen sobre el tema. Sin embargo, aunque los estudios con MAbs funcionan bien, su desarrollo es caro, lento, muy laborioso (SYMONDSON y col. 1999) y sólo permite la detección de ciertos estados de desarrollo. De ahí surge la necesidad de desarrollar técnicas de detección de ADN para el análisis del contenido estomacal del depredador.
Aplicación de técnicas moleculares: detección de ADN de la presa
En los últimos años se han publicados diversos estudios de análisis del contenido estomacal en artrópodos depredadores basados en la reacción en cadena de la polimerasa o PCR (Polymerase Chain Reaction).
Los primeros estudios publicados que aplicaron estas técnicas al control integrado de plagas fueron realizados por nuestro grupo (AGUSTÍ y col,1999; 2000). En estos trabajos se desarrollaron marcadores moleculares específicos de dos de las especies plaga mas importante en el cultivo de tomate en el Noreste español, el lepidóptero Helicoverpa armigera (Hübner) y la mosca blanca Trialeurodes vaporariorum, lo cual permitió estudiar su depredación por parte de los heterópteros míridos Dicyphus tamaninii (Wagner) y Macrolophus caliginosus (Wagner).
Mediante secuenciación de fragmentos generados por RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), alineación y comparación de las secuencias obtenidas, se diseñaron cebadores específicos de estas dos especies plaga. Los estudios de especificidad mostraron que estos marcadores eran capaces de detectar específicamente las especies para las que habían sido diseñados y no otras aunque estuvieran estrechamente relacionadas, ni por supuesto los depredadores (Figura 2A). Posteriormente se estudió el límite de la detección, es decir, hasta cuanto tiempo después de haber ingerido la presa era posible su detección. En ambos estudios se determinó que la detección era posible pasadas 4 horas después de la ingestión (Figura 2B).
A partir de aquí fueron publicados otros estudios de depredación como el de Chen y col. (2000) donde se diseñaron marcadores específicos a partir de la región mitocondrial COII (Cytochrome Oxidase II) para la identificación de depredadores de seis especies de pulgones en trigo, o el de Hoogendoorn y Heimpel (2001) en el que se diseñaron marcadores específicos del taladro del maíz, el lepidóptero Ostrinia nubilalis (Hübner) a partir de la región ribosomal ITS-1 (Internal Transcribed Spacer-1). En este caso, el tiempo de vida media, es decir, el tiempo en el que la detección fue posible en el 50% de los depredadores analizados fue de seis horas y media.
A fin de estudiar la depredación ejercida por diversas especies de heterópteros antocóridos y arañas sobre Cacopsylla pirycola (Förster), una de las principales plagas del peral en los EE UU y en particular en el área de California, se diseñaron cebadores específicos para esta especie a partir de la región mitocondrial COI (Cytochrome oxidase I). Dado que aquí en España existe la misma problemática con otra especie, la psila Cacopsylla pyri (L.), se diseñó un marcador capaz de detectar de forma exclusiva ambas especies y así poder ser utilizado en estudios de depredación también en Europa. En este caso, y debido a la mejora de la técnica utilizada que se basaba en la utilización de una región multicopia respecto a anteriores estudios, la detección en el tiempo fue posible hasta 32 horas después de la ingestión de una a cinco ninfas de C. pyricola y el tiempo de vida media de la detección se estableció en 21 horas (AGUSTI y col., 2003a) (Figura 3).
Estas mismas técnicas fueron utilizadas para estudiar la depredación que ejercen las arañas linífidas, como Erigone attra (Blackwell), E. dentipalpis (Wider) o Leptyphantes tenuis (Blackwell) presentes en campos de trigo del suroeste del Reino Unido (Agustí y col. 2003b). Estas arañas se conocen por ser depredadoras de varias especies de pulgones que pueden estar presentes en el cultivo, como Sitobion avenae (F.) o Metopolophium dirhodum (Walker).
En este estudio se demostró por primera vez la utilidad de estas herramientas moleculares en estudios de control biológico de campo. El objetivo fue demostrar como la disponibilidad de especies no-plaga como presa ayudaba a mantener las poblaciones de depredadores en el cultivo en estaciones desfavorables.
El sistema escogido fue la interacción entre arañas linífidas depredadoras y colémbolos, un grupo importante de especies no-plaga siempre presentes en el cultivo, incluso en invierno cuando las condiciones para los pulgones (principales especies plaga del cultivo en verano) son desfavorables. Se desarrollaron marcadores moleculares para las tres especies de colémbolos más abundantes en el área de estudio. Los cebadores diseñados fueron altamente específicos y no detectaron otras especies de colémbolos, ninguna especie de pulgón, ni otras especies plaga potencialmente presentes en el cultivo, así como ninguna araña linífida, eliminando así la posibilidad de que se obtuvieran falsos negativos.
Se determinó que el límite de la detección de estas presas en arañas linífidas era extremadamente largo, pudiéndose detectar el 100% de los depredadores que habían ingerido colémbolos hasta pasadas 24 horas. Posteriormente se analizaron arañas linífidas recolectadas en campos de trigo en invierno con los cebadores específicos para las tres especies de colémbolos. Los resultados mostraron que un 64% de las arañas analizadas habían ingerido alguna de las tres especies de colémbolos. De entre estas, un 48% había ingerido una sola especie y un 16% había ingerido dos, incluso se pudieron determinar ciertas preferencias entre las especies consumidas. Este estudio permitió demostrar la importancia y el papel real que ejercen determinadas presas secundarias, como los colémbolos, en el mantenimiento de las poblaciones de depredadores en el cultivo durante épocas desfavorables en las que no están presentes las plagas a controlar.
El estudio de la relación huésped-parasitoide
Estas herramientas moleculares también pueden utilizarse para la determinación y el seguimiento de la eficacia de parasitoides. Las técnicas tradicionalmente utilizadas para determinar los porcentajes de parasitismo en campo, se basan en la recolección y el mantenimiento del huésped en condiciones controladas de temperatura, humedad relativa y fotoperíodo hasta el completo desarrollo y la emergencia del parasitoide adulto. Este procedimiento presenta en muchos casos una serie de inconvenientes, como el hecho de ser un proceso lento (tanto que a veces puede alargarse hasta doce meses); poco preciso debido a la elevada mortalidad que puede darse durante el mantenimiento del huésped; no ser suficientemente sensible como para detectar e identificar huevos y primeros estadios del parasitoide debido a su pequeño tamaño; y finalmente que en la mayoría de casos requiere de un especialista en la identificación morfológica del adulto emergido. Para resolver estos problemas al determinar los porcentajes de parasitismo se han desarrollado iniciadores específicos con el mismo tipo de métodos moleculares que habían sido utilizados anteriormente en estudios de depredación.
Un ejemplo de la utilización de estas herramientas moleculares para la evaluación del parasitismo natural ejercido sobre una plaga fue el estudio del parasitismo ejercido sobre taladro del maíz, O. nubilalis, por parte de dos especies de dípteros taquínidos, Lydella thompsoni (Herting) y Pseudoperichaeta nigrolineata (Walker) (Figura 4) (AGUSTÍ y col., 2005). Dado que tanto en el sur de Francia como en España se encuentra también presente otro taladro del maíz, Sesamia nonagrioides Lefèbvre, los marcadores moleculares de las dos especies de taquínido se diseñaron de manera que pudieran ser utilizados para ambas especies de taladro. Los dos marcadores moleculares se desarrollaron a partir de la región mitocondrial COI y fueron altamente específicos para las dos especies de taquínidos y se utilizaron para estudiar la distribución de estos dos parasitoides en Francia. Se muestrearon doce localidades repartidas por todo el territorio francés (seis en el norte, tres en el centro y tres en el al sur) y se determinaron los porcentajes de parasitismo tanto por método tradicional como por el método molecular, lo cual nos permitió también comparar ambos métodos en condiciones de campo.
Los resultados demostraron que ambas especies de taquínidos de distribuían homogéneamente en todo el territorio, contrariamente a lo que se mantenía hasta la fecha que era que una de les especies se distribuía más hacia el norte y la otra más hacia el sur. Por lo que se refiere a la comparación de métodos, no se encontraron diferencias significativas entre los porcentajes de parasitismo obtenidos mediante los dos métodos de evaluación.
Este resultado, junto con las ventajas ya mencionadas sobre la utilización de los métodos moleculares como la de ser un método rápido y fiable, que detecta todos los estados de desarrollo y que no requiere de un experto en identificación morfológica, hacen que el método molecular pueda ser el mas adecuado para este tipo de estudios.
Todo lo explicado anteriormente permite concluir que las técnicas moleculares son herramientas muy potentes a través de las cuales podemos profundizar en el estudio de las relaciones tróficas entre las plagas y sus enemigos naturales que no serian abordables por otros métodos convencionales.
Disponemos, por lo tanto, de nuevas técnicas que nos permiten avanzar en la aplicación del control biológico de plagas tanto mediante inoculación como mediante la conservación de la fauna útil.
Agradecimientos: La doctora Nuria Agustí se reincorporó al IRTA en el año 2005 gracias a un contrato Ramón y Cajal del Ministerio de Educación y Ciencia.
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