Sección: Frutales
El fuego bacteriano (Erwinia amylovora) es una de las enfermedades más importantes del manzano, y su control integrado requiere el cultivo de variedades poco sensibles. En este trabajo, hemos evaluado la sensibilidad a esta enfermedad de la colección de variedades de manzano autóctonas de España del ITGA de Navarra. Debido a las limitaciones que impone el manejo de E. amylovora, y para agilizar la identificación de variedades poco sensibles, hemos valorado la utilización de un ensayo rápido de sensibilidad en hoja como criterio de selección para la realización de ensayos en brotes, que son más precisos. La evaluación de 78 variedades de manzano mostró una correlación baja, pero significativa, de r = 0.56 (a = 0.01) entre los índices de progresión de la enfermedad obtenidos con ambos ensayos. Nuestros resultados indican que el ensayo en hoja no es fiable para la selección de variedades poco sensibles a fuego bacteriano, pero sí para descartar variedades mediana o altamente sensibles, y así optimizar recursos en situaciones en las que es necesario evaluar un gran número de variedades. De acuerdo a los ensayos en brotes, las variedades se clasificaron en tres grupos de sensibilidad, identificándose 36 variedades (46,2%) poco sensibles a fuego bacteriano.
El fuego bacteriano da nombre a una enfermedad muy contagiosa causada por la bacteria Erwinia amylovora (Figuras 1 y 2), que tiene como huéspedes a frutales y plantas ornamentales de la familia de las rosáceas (VANNESTE, 2000). Esta enfermedad es extremadamente dañina en peral y manzano, siendo el peral el huésped más sensible. Frecuentemente se encuentra en otros frutales como membrillero y níspero y en plantas ornamentales y silvestres como Cotoneaster, Crataegus, Photinia, Pyracantha, y Sorbus. Los síntomas y el ciclo de esta enfermedad, así como su epidemiología y la evolución de la enfermedad en España, han sido ya ampliamente descritos en distintos artículos (LÓPEZ et al., 1996; MONTESINOS y LÓPEZ, 1998; MONTESINOS y LLORENTE, 1999; MONTESINOS et al., 1999; LÓPEZ et al., 2002). La bacteria se multiplica bajo condiciones de humedad elevada y, en función del punto de entrada en el árbol (aberturas naturales en flores y frutos, extremos de brotes o a través de heridas producidas por daños físicos o climáticos), la infección progresa por la planta invadiendo las flores, los frutos inmaduros, los brotes, las hojas y las ramas (Figura 2). La enfermedad es altamente contagiosa y, una vez instalada la bacteria, causa la muerte progresiva de los árboles sensibles. Las pérdidas de producción son debidas a la destrucción total o parcial del árbol. En algunos casos los daños pueden ser tan graves que sea inviable el cultivo rentable de determinadas variedades. Por esta razón, una de las consecuencias más graves de la enfermedad es la modificación de la estructura varietal de una zona frutícola.
La estrategia de control de la enfermedad depende de la situación en la que se encuentre un país.
En los países o áreas frutícolas en los que la enfermedad no está establecida y se han detectado pocos focos bien limitados, el control se dirige a la erradicación de la enfermedad. Por el contrario, el control va dirigido a la reducción del daño en los países o zonas en los que, superada la fase de erradicación, la enfermedad ya se ha instalado definitivamente.
La erradicación consiste en la destrucción del material infectado, bien sea material en producción como de importación, con el objetivo final de eliminar todas las posibles fuentes de inóculo, aunque ningún país ?con la excepción de España? ha conseguido la erradicación de la bacteria. A pesar de ello, los métodos dirigidos a la erradicación tienen el efecto beneficioso de retrasar la diseminación de la enfermedad y limitar la gravedad de las epidemias durante los primeros años de entrada del patógeno en un país. Una vez que la enfermedad se ha establecido en una zona frutícola y su eliminación no es viable, se impone la aplicación de medidas dirigidas a la reducción del daño, y que incluyen principalmente la realización de podas sanitarias con utensilios bien desinfectados, la aplicación de fitosanitarios y la plantación de variedades poco sensibles.
Desde la aparición del fuego bacteriano en Europa en 1957, España ha permanecido durante cuatro décadas libre de la enfermedad. A raíz de la detección de la enfermedad en el sur de Francia a escasos 50 kilómetros de la frontera española, el Instituto Nacional de Investigaciones Agrarias (INIA) y el Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación (MAPA) desarrollaron un plan global de actuación, que incluyó planes anuales de prospecciones fitosanitarias de material vegetal tanto en producción como en vivero (LÓPEZ et al., 1987). En este aspecto, cabe destacar también el gran esfuerzo que desde entonces se viene realizando en España para determinar las zonas de riesgo climático (MONTESINOS y LLORENTE, 1999) así como la puesta a punto de técnicas muy sensibles para la detección de E. amylovora en material asintomático (GORRIS et al., 1996; LLOP et al., 2000). En el verano de 1995 fue detectado el primer foco de fuego bacteriano en Guipúzcoa en manzanos destinados a la producción de sidra (LÓPEZ et al., 2002). Posteriormente, E. amylovora ha sido aislada de plantas de peral, manzano, membrillero, Pyracantha, Cotoneaster y Crataegus localizadas en zonas nororientales y centrales del país. Inmediatamente después de la aparición del primer foco, en España se tomaron medidas para evitar la dispersión del patógeno, que incluyeron inspecciones de campo exhaustivas y la erradicación de todo el material infectado. En la Comunidad Foral de Navarra la mayoría de los aislados de esta bacteria han sido encontrados en distintas variedades del arbusto ornamental Pyracantha, por lo cual se tomaron medidas excepcionales, entre las que cabe destacar la Orden Foral del 13 de marzo de 1999 por la que se prohíbe la plantación de cualquier variedad de Pyracanta en todo el territorio de esta Comunidad Autónoma. En conjunto, estas rápidas y drásticas medidas han contribuido sin duda a que en los últimos años no se hayan detectado nuevos focos de la enfermedad en el país, lo que supone un éxito sin precedentes en la historia del control del fuego bacteriano. Sin embargo, considerando la rápida progresión de la enfermedad en otros países mediterráneos (VAN DER ZWET, 1996) y con el fin de minimizar los efectos de un posible establecimiento del fuego bacteriano en España, es necesario además establecer otras medidas de control apropiadas, como la utilización de variedades poco sensibles a la enfermedad y que estén adaptadas a las condiciones agroclimáticas de las zonas productoras.
La sensibilidad de la planta huésped es muy variable, y depende de diversos factores, siendo los más importantes la especie y variedad del cultivo, el estado fenológico de la planta, y las condiciones ambientales particulares de la zona. En la práctica, el grado de sensibilidad varía de manera continua desde una alta sensibilidad hasta alta resistencia, aunque no existe ninguna variedad comercial con resistencia completa al patógeno. Debido a su importancia económica, se ha evaluado ya la sensibilidad de las principales variedades comerciales de manzano, peral y especies ornamentales, así como de los principales patrones (PAULIN, 1990; PAULIN y PRIMAULT, 1993; VAN DER ZWET y BEER, 1995).
Cabe destacar las variedades de peral Blanquilla y Limonera como altamente sensibles, y Conference y Ercolini como moderadamente y poco sensibles, respectivamente. En manzano las variedades Fuji e Idared están clasificadas como altamente sensibles y como poco sensibles Royal Gala y Starking Delicious, entre otras (MONTESINOS y LÓPEZ, 1998). El grado de resistencia, sin embargo, se ve en parte afectado por el estado fenológico de la planta y por las condiciones ambientales, por lo que una variedad comercial dada puede ser incluida en distintos grados de sensibilidad por distintos autores (VAN DER ZWET Y BEER, 1995); así, por ejemplo, la variedad Granny Smith se considera como medianamente sensible por autores americanos, mientras que los autores franceses la clasifican como muy sensible. Aunque estas variaciones de sensibilidad no son drásticas, la resistencia de una variedad a fuego bacteriano no puede ser considerada como una característica absoluta, y es por tanto necesario evaluarla empíricamente en las condiciones ambientales particulares de la zona en la que va a cultivarse.
Los ensayos de sensibilidad varietal al fuego bacteriano pasan inevitablemente por la inoculación del material vegetal con E. amylovora. Esta bacteria está considerada como patógeno de cuarentena en España, por lo cual el país es zona protegida de acuerdo con el Real Decreto 2071/1993 de 26 de noviembre. Esto implica que todos los experimentos de inoculación deben ser realizados con la debida autorización oficial, en cámaras climáticas provistas de apropiadas medidas de contención y bajo estricta vigilancia para evitar la dispersión del patógeno. Generalmente, la inoculación se realiza depositando una suspensión bacteriana en flores o sobre heridas realizadas en brotes jóvenes de plantones; posteriormente, el material vegetal se mantiene en condiciones que favorezcan el desarrollo de la infección, de manera que el grado de progresión de la necrosis permite comparar la sensibilidad entre las distintas variedades (Figuras 3 y 4). La ventaja de los ensayos realizados en invernadero o cámaras climáticas es que las condiciones ambientales (temperatura, humedad relativa y foto período) pueden fijarse y estandarizarse. No obstante, al ser una enfermedad cuyo desarrollo está muy influido por las condiciones ambientales y por la cepa de E. amylovora que cause la infección (PAULIN et al., 1993; CABREFIGA, 2004; MARTINEZ BILBAO, 2006), las observaciones de campo son imprescindibles para validar el grado de resistencia estimado mediante ensayos en condiciones controladas.
Evaluación de variedades de manzano autóctonas de España
En el año 1985, el Instituto Técnico de Gestión Agrícola de Navarra (ITGA) puso en marcha un proyecto para la recuperación de variedades de manzano autóctonas del noreste español, lo que dio como resultado el establecimiento de una colección de 253 variedades (LIZAR, 1996). El objetivo general de la colección es la conservación de una importante fuente de diversidad, por lo que se ha abordado la caracterización genética y agronómica de estas variedades, así como la evaluación de su sensibilidad a las principales enfermedades del manzano. A corto plazo, esta colección se está utilizando con el fin de seleccionar variedades aptas para la producción de manzana de sidra y también para una posible explotación en el futuro como fuentes de resistencia a enfermedades en programas de mejora (B. LIZAR, datos no publicados).
En este trabajo hemos abordado la caracterización de la sensibilidad a fuego bacteriano de esta colección de variedades autóctonas, ya que ésta es una de las tres enfermedades de mayor importancia en el manzano.
Nuestra estrategia de trabajo ha estado fuertemente condicionada por el alto número de variedades a estudiar, la necesidad de realizar los análisis en cámaras destinadas únicamente a ese fin para evitar la dispersión del patógeno y la creciente demanda por parte de los fruticultores de variedades poco sensibles a fuego bacteriano. Por ello el método de selección que hemos utilizado se ha realizado en dos etapas. La primera consistió en la evaluación de todas las variedades mediante la inoculación de hojas obtenidas de árboles de campo (ensayos en hoja). Posteriormente se inocularon brotes jóvenes de plantones procedentes de las variedades seleccionadas en los ensayos en hoja e injertadas sobre patrón M9 (ensayos en brote). La realización de ambos ensayos con las mismas variedades nos permitió evaluar la validez del ensayo en hojas y facilitar la identificación de variedades potencialmente menos sensibles para poder proveer a los agricultores de datos referentes a la sensibilidad de distintas variedades en campo, desde los primeros años de experimentación.
Ensayo en hoja
La evaluación de la sensibilidad a enfermedades de especies leñosas conlleva una serie de problemas derivados de la tipología del material vegetal, como pueden ser la estacionalidad, un período vegetativo extenso, o la necesidad de una gran cantidad de espacio para el desarrollo de las plantas, entre otros. Con el fin de soslayar estas dificultades, algunos autores han utilizado hojas o clones propagados in vitro para evaluar la sensibilidad a diversos patógenos, como por ejemplo Pseudomonas syringae pv. Syringae (YESSAD et al., 1992; MORAGREGA et al., 2003) o Erwinia amylovora (NORELLI et al., 1988; DONOVAN, 1991; CHEVREAU et al., 1998). La evaluación de la sensibilidad a P. syringae pv. syringae ha sido muy exitosa, observándose un rápido desarrollo de los síntomas (48 h), así como una alta correlación entre los resultados con hojas y con plantas completas (MORAGREGA et al., 2003). Sin embargo, esto no fue así en el caso de E. amylovora (DONOVAN, 1991), ya que los resultados obtenidos con el ensayo en hojas no mostraron correlación con los datos de sensibilidad derivados de ensayos en brotes o en campo, aunque esto pudo deberse a que, como reconoce la propia autora del trabajo, quizás los ensayos no fueron llevados a cabo bajo las condiciones más adecuadas, o a que el material vegetal utilizado no se encontraba en pleno crecimiento activo durante la realización de la experimentación. El ensayo en hoja ofrece ventajas importantes, como son la drástica reducción del espacio necesario, la gran cantidad de variedades que pueden ser ensayadas en poco tiempo y la abundancia del material necesario para estos propósitos. Por estas razones, decidimos comprobar la utilidad del análisis en hoja en el estudio de la sensibilidad del manzano a fuego bacteriano, con el fin último de seleccionar aquellas variedades poco sensibles y concentrar los esfuerzos de selección en un número reducido de ellas. Para ello se utilizó básicamente el método de Donovan (1991) pero introduciendo algunas modificaciones en los métodos de inoculación del material vegetal y de evaluación de la progresión de la necrosis. También se hizo hincapié en que el material vegetal utilizado fuera muy tierno, asegurando de esta manera que se encontrara en crecimiento activo. Para esto último se limitó de forma estricta el tamaño de las hojas seleccionadas para el ensayo.
El protocolo de inoculación (DONOVAN, 1991) se resume en la Figura 3. Brevemente, las hojas, de 2 a 4 cm de longitud, se obtuvieron en abril-mayo de árboles de aproximadamente 15 años de edad crecidos en campo. Para cada variedad se ensayaron tres árboles, inoculando siete hojas de cada árbol. Después de desinfectarlas superficialmente, las hojas se colocaron sobre papel de filtro húmedo en recipientes de plástico herméticos. Para la inoculación se utilizó la cepa E. amylovora UPN500, aislada de un peral infectado de forma natural en Guipúzcoa en 1998, ya que tiene una virulencia comparable a otras cepas utilizadas en experimentos similares (CABREFIGA, 2004; MARTINEZ BILBAO, 2006). Se practicó una incisión en la base del peciolo, sobre la cual se depositaron 5 ?l de una suspensión con 108 ufc x ml-1 de la cepa UPN500, y las hojas se mantuvieron en cámaras climáticas a 20ºC y con un fotoperiodo 16/8 h (día/noche). La sensibilidad al fuego bacteriano se evaluó mediante la cuantificación de la evolución y extensión de la necrosis cinco días después de la inoculación.
Para ello se utilizó una escala arbitraria que varió entre 0 (ausencia de necrosis) a 4 (hoja totalmente necrótica); estos valores se transformaron en porcentajes para obtener el Índice de Progresión de la Enfermedad, o NSI (Necrosis Severity Index) (DURON et al., 1987). Con el fin de establecer una correlación con el ensayo en brotes, el NSI correspondiente a cada repetición se transformó al índice USDA, para luego calcular el promedio correspondiente a cada variedad. Esta escala asigna al valor de NSI obtenido para cada repetición una escala de diez niveles (THOMAS y JONES, 1992) tal y como sigue: 0, 0%; 1, 1-3%; 2, 4-6%; 3, 7-12%; 4, 13-25%; 5, 26-50%; 6, 51-75%; 7, 76-88%; 8, 89-99%; 9, 100%.
Los síntomas comenzaron a desarrollarse dos o tres días después de la inoculación en las hojas inoculadas de todas las variedades, y en las más sensibles la necrosis progresó rápidamente desde el nervio central hacia los nervios laterales y el tejido internerval.
Eventualmente, la necrosis cubrió toda la hoja, siendo visibles exudados bacterianos en algunos casos. Los ensayos en hoja permitieron clasificar 233 variedades en cinco categorías o niveles arbitrarios de sensibilidad en función del NSI observado.
Como se puede observar en la Tabla 1, el rango de variación del NSI fue de 10 a 90%, lo cual es comparable con el rango observado (19-92%) en otro ensayo en hoja para evaluar la sensibilidad de variedades de peral a P. syringae pv. syringae (MORAGREGA et al., 2003). Un 55,8% de las variedades de manzano autóctonas estudiadas presentaron un NSI inferior al 50%, lo que correspondería a una sensibilidad media-baja al fuego bacteriano según el código GRIN (Germplasm Resources Information Network) (THOMASY JONES, 1992). Las 40 variedades que presentaron los valores más bajos de NSI fueron seleccionadas para estudios posteriores de sensibilidad mediante ensayos en brote.
Ensayo en brote
La principal ventaja de este tipo de ensayo es que el análisis de la sensibilidad al fuego bacteriano se realiza sobre material vegetal en crecimiento activo, lo que supone un mayor acercamiento a las condiciones de campo. Por ello, este tipo de ensayo es el mayoritariamente utilizado para los estudios de sensibilidad de variedades de frutales frente a distintos patógenos, incluida E. amylovora (DURON et al., 1987; NORELLI et al., 1988; THOMAS y JONES, 1992). En general, la disponibilidad de espacio es el principal factor que limita el número de variedades que se estudiarán; además, la inoculación de plantas con E. amylovora en España está sometida a otra serie de importantes restricciones, por lo que es conveniente aplicar primero criterios de selección que permitan evaluar las variedades que tienen un mayor interés agrícola.
En los ensayos en brote se incluyeron las 40 variedades que presentaron el menor NSI en el análisis en hoja, así como otras 38 variedades que eran de interés para el ITGA por sus características agronómicas.
La inoculación de las plantas se realizó siguiendo procedimientos ya descritos (NORELLI et al., 1988), y se resume en la Figura 4. Para la preparación de los plantones, las variedades se injertaron sobre patrón M9 (clasificado como poco sensible al fuego bacteriano), se transplantaron a macetas y se mantuvieron en umbráculos en campo hasta tres semanas antes de la inoculación, momento en el cual se transfirieron a invernadero. Para cada variedad se inocularon de 5 a 8 plantones, y de 1 a 3 brotes por plantón. La cepa utilizada para las inoculaciones y las condiciones de incubación de las plantas después de la inoculación fueron las mismas que las utilizadas en los ensayos en hoja. La inoculación se realizó mediante un corte transversal de la hoja más joven del brote con unas tijeras que fueron previamente sumergidas en una suspensión de E. amylovora UPN500 a una concentración de 108 ufc x ml-1. Los síntomas comenzaron a aparecer 5 ó 6 días después de la inoculación, y la progresión de la necrosis se evaluó a los 12 d utilizando una escala arbitraria que varió entre 0 (ausencia de necrosis) a 4 (necrosis total de la parte apical del brote) (DURON et al., 1987), lo que permitió calcular el Índice de Progresión de la Enfermedad o NSI (Necrosis Severity Index) para cada variedad.
Las 78 variedades analizadas presentaron sensibilidad diferencial a fuego bacteriano y, según los correspondientes valores de NSI y siguiendo criterios establecidos (DURON et al., 1987; VAN DER ZWET y BEER, 1995), se clasificaron en tres categorías o grados de sensibilidad: poco sensible, medianamente sensible y altamente sensible (Figura 4), La categoría altamente sensible estuvo representada por Granny Smith, variedad comercial incluida en nuestros ensayos como control, mientras que en la categoría poco sensible se incluyeron variedades como 1.1.20 o 3.1.100.
Correlación entre los ensayos en hoja y brote
Los valores de NSI del ensayo en brotes tiernos se correlacionaron, mediante el método de los mínimos cuadrados, con los valores transformados a la escala USDA del ensayo en hojas para un grupo de 78 variedades (Figura 5). Como resultado de esta correlación, se obtuvo una recta de regresión de ecuación y = 0,0171x + 3,6738, con un coeficiente de correlación lineal de Pearson de r = 0,56 a un nivel de significación de á = 0,01. En dos trabajos anteriores (DONOVAN, 1991; CHEVREAU et al., 1998), sin embargo, no se obtuvo una correlación significativa entre estos dos tipos de ensayo de sensibilidad a fuego bacteriano, lo que pudo deberse a una técnica de inoculación inapropiada o, como apuntó uno de los mismos autores (DONOVAN, 1991), a que el tejido vegetal de las hojas no se encontrara en crecimiento activo bajo las condiciones de inoculación en invernadero. Además, pensamos que pudo haber influido el hecho de que en esos trabajos se utilizó un modelo binomial, en donde se consideraron resistentes los individuos para los que la necrosis no pasó del peciolo, y sensibles al resto.
Esta forma de evaluar los resultados podría ser muy poco realista dada la naturaleza continua de los datos que se obtienen al realizar ambos ensayos.
En comparación con el ensayo en brotes, el ensayo realizado sobre hoja desprendida mostró una resolución baja, ya que los valores de sensibilidad observados se distribuyeron exclusivamente entre los valores 2,5 y 6,5 de la escala USDA, que varía entre 0 y 9. Sin embargo, los valores de sensibilidad de estas variedades según el ensayo en brotes se distribuyeron a lo largo de toda la escala de evaluación.
Por ello, la recta de regresión lineal entre las dos variables tiene una pendiente muy baja (Figura 5). Una consecuencia importante de esta baja resolución es que es difícil establecer un punto de corte en la escala USDA que permita seleccionar las variedades poco sensibles. Así, la selección de variedades que mostraron valores de sensibilidad menores de 5 en la escala USDA conllevó la selección de variedades que se distribuían en todas las categorías de sensibilidad, según el ensayo en brotes. Sería posible, sin embargo, aplicar un criterio más restrictivo y seleccionar las variedades con valores de sensibilidad USDA menores, aunque esto conllevaría igualmente el riesgo de descartar variedades potencialmente poco sensibles a fuego bacteriano. Por otra parte, 17 de las 19 variedades que mostraron valores USDA iguales o mayores a 5 fueron clasificadas como medianamente o muy sensibles según el ensayo en brotes.
En consecuencia, la selección de variedades que presentaran valores USDA menores de 5 según el ensayo en hojas?u otro valor apropiado? podrían permitir descartar con alta fiabilidad aquellas variedades potencialmente sensibles a fuego bacteriano.
De esta manera, el esfuerzo experimental podría concentrarse en la evaluación de un menor número de variedades; esto es especialmente importante en zonas como España, en la que las inoculaciones con E. amylovora deben hacerse en instalaciones debidamente protegidas y en las que el espacio es muy limitado.
Conclusiones
Los valores de sensibilidad de diversas variedades de manzano a fuego bacteriano obtenidos mediante un ensayo en hojas mostraron una correlación baja, pero significativa, con los valores obtenidos para las mismas variedades utilizando un ensayo con brotes jóvenes. Según nuestros resultados, el método de inoculación en hojas podría utilizarse con alta fiabilidad para la identificación de una porción de las variedades altamente sensibles a fuego bacteriano, de manera que éstas pudieran excluirse de posteriores ensayos y así optimizar la utilización de los recursos de investigación. Los ensayos de inoculación de brotes con 78 variedades de manzano autóctonas del noreste español nos han permitido identificar un grupo de 36 variedades que han mostrado una sensibilidad baja a fuego bacteriano.
Summary: Fire blight (Erwinia amylovora) is one of the most important diseases of apple, and its integrated control requires the cultivation of varieties with low susceptibility to the pathogen. In this work, we evaluated the susceptibility to fire blight of the collection of Spanish local apple cultivars maintained by the ITGA of Navarra. Due to the current limitations for the manipulation of E. amylovora, and to speed up the identification of varieties with low susceptibility, we implemented a rapid susceptibility assay in detached leafs to narrow down the number of varieties to be assayed using actively growing shoots, which is a more precise method. Upon evaluation of 78 varieties, we found a low, but significant, correlation (r = 0.56; á = 0.01) between the disease progression index estimated for each variety with both methods. Our results indicate that the detached leaf assay is not reliable for the direct selection of varieties with low susceptibility to fire blight, although it was useful to identify varieties with a medium or high susceptibility of the pathogen. The exclusion of these varieties from shoot assays contributes to resource optimization and limits the potential dispersal of the pathogen, especially in those situations where it is necessary to evaluate a large number of varieties. Using the shoot assays, we were able to classify the 78 varieties in three susceptibility groups; 36 varieties (46.2%) were included in the group with lower susceptibility to the pathogen.
KEY WORDS: Phytopathogenic bacteria, inoculation, disease resistance, susceptibility, virulence.
Agradecimientos: Los autores agradecen alGerente y al resto del personal del ITGA su inestimable colaboración durante la realización de este trabajo. Este trabajo ha sido financiado con fondos de los proyectos CICYT AGF98-0402-C03 y AGL2001-1948-CO2-01. AMB ha sido financiado con una beca predoctoral otorgada por el Gobierno de Navarra y una beca puente de la Universidad Pública de Navarra. Durante la escritura de este artículo JM ha disfrutado de la ayuda PR2005-0299 del Ministerio de Educación y Ciencia.
BIBLIOGRAFÍA
CABREFIGA, J. 2004. Fire blight (Erwinia amylovora) of rosaceous plants. Pathogen virulence and selection and characterization of biological control agents. Tesis Doctoral, Universidad de Gerona, Gerona.
CHEVREAU, E.; BRISSET, M. N.; PAULIN, J. P.; JAMES, D. J. (1998). Fire blight resistance and genetic trueness-to-type of four somaclonal variants from the apple cultivar Greensleeves. Euphytica 104: 199-205.
DONOVAN, A. (1991). Screening for fire blight resistance in apple (Malus pumila) using excised leaf assays from in vitro and in vivo grown material. Annals of Applied Biology 119: 59-68.
DURON, M.; PAULIN, J. P.; BRISSET, M. N. (1987). Use of in vitro propagated plant material for rating fire blight susceptibility. Acta Horticulturae 217: 317-324.
GORRIS, M. T.; CAMBRA, M.; LLOP, P.; LÓPEZ, M. M.; LECOMTE, P.; CHARTIER, R.; PAULIN, J. P.; BONN, W. G. (1996). A sensitive and specific detection of Erwinia amylovora based on the ELISA-DASI enrichment method with monoclonal antibodies. Acta Hortic. 411: 41-46.
LIZAR, B. (1996). Selección del manzano autóctono de Navarra. Navarra Agraria 99: 19-30.
LLOP, P.; BONATERRA, A.; PEÑALVER, J.; LÓPEZ, M. M. (2000). Development of a highly sensitive nested-PCR procedure using a single closed tube for detection of Erwinia
amylovora in asymptomatic plant material. Appl. Environ. Microbiol. 66: 2071-2078.
LÓPEZ, M. M.; NOVAL, C.; PALAZÓN, I.; SAMPAYO, M. (1987). El fuego bacteriano. Ed. Subdirección General de Sanidad Vegetal, Ministerio de Agricultura Pesca y Alimentación, Madrid
LÓPEZ, M. M.; MONTESINOS, E.; LECOMTE, P.; PAULIN, J. P. (1996). El fuego bacteriano del peral, una amenaza permanente: situación actual, epidemiología y control de la enfermedad. Fruticultura Profesional 78: 79-87.
LÓPEZ, M. M.; LLOP, P.; RICO, A.; ORTÍZ, A.; MURILLO, J.; DONAT, V.; PEÑALVER, J.; LLORENTE, I.; BADOSA, E.; MONTESINOS, E. (2002). Chronicle of a disease foretold (that advances slowly): the 2001 Spanish situation. Acta Horticulturae 590: 35-38.
MARTÍNEZ BILBAO, A. 2006. Evaluación de la resistencia de variedades de manzano autóctonas de España a fuego bacteriano (Erwinia amylovora) y moteado (Venturia inaequalis). Tesis Doctoral, Universidad Pública de Navarra, Pamplona.
MONTESINOS, E.; LÓPEZ, M. M. (1998). El fuego bacteriano de las rosáceas. Situación actual y perspectivas de control. PHYTOMA 104: 24-36.
MONTESINOS, E.; LLORENTE, I. (1999). Evolución del fuego bacteriano y estudio preliminar de las zonas de riesgo climático en el noreste español. Fruticultura Profesional 103: 5-22.
MONTESINOS, E.; LÓPEZ, M. M.; MURILLO, J. (1999). Importancia y situación actual del fuego bacteriano Erwinia amylovora en España. Epidemiología, daños y prevención. PHYTOMA 114: 128-136.
MORAGREGA, C.; LLORENTE, I.; MANCEAU, C.; MONTESINOS, E. (2003). Susceptibility of European pear cultivars to Pseudomonas syringae pv. syringae using immature fruit and detached leaf assays. European Journal of Plant Pathology 109: 319-326.
NORELLI, J. L.; ALDWINKLE, H. S.; BEER, S. V. (1988). Virulence of Erwinia amylovora strains to Malus sp. Novole plants grown in vitro and in the greenhouse. Phytopathology 78: 1292-1297.
PAULIN, J. P. (1990). Fire blight of Pomoideae (Erwinia amylovora, Burrill, Winslow et al). Applied research in Europe (1978-1988). EUR 12601 ECSC-EEC-EAEC, Brussells,
Luxembourg
PAULIN, J. P.; LACHAUD, G.; LESPINASSE, Y. (1993). Role of the aggressiveness of strains of Erwinia amylovora in the experimental evaluation of susceptibility of apple cultivars to fire blight. Acta Horticulturae 338: 375-376.
PAULIN, J. P.; PRIMAULT, J. (1993). Feu bactérien et culture du pommier cidre. Ed. INRA-CFC, Paris
THOMAS, T. M.; JONES, A. L. (1992). Severity of fire blight on apple cultivars and strains in Michigan. Plant Disease 76: 1049-1052.
VAN DER ZWET, T.; BEER, S. V. (1995). Fire bligt. Its nature, prevention and control: A practical guide to integrated disease management, Agriculture Information Bulletin, 91 pp. USDA.
VANNESTE, J. L. (2000). Fire blight. The disease and its causative agent, Erwinia amylovora. CABI Publishing, Wallingford
YESSAD, S.; MANCEAU, C.; LUISETTI, J. (1992). A detached leaf assay to evaluate virulence and pathogenicity of strains of Pseudomonas syringae pv. syringae on pear. Plant Disease 76: 370-373.
