Sección: 16º symposium internacional sobre la problemática actual de las resistencias en cultivos mediterráneos
La resistencia a insecticidas de dos de las plagas más importantes del manzano (la carpocapsa, Cydia pomonella (L.)) y del peral (la propia C. pomonella y la psylla, Cacopsylla pyri (L.)) ha sido mencionada en diferentes países donde el manzano y el peral se cultivan, pero no se habían realizado trabajos sobre poblaciones españolas hasta el momento. Por ello, se iniciaron hace algunos años trabajos con el objetivo de comprobar la existencia de poblaciones resistentes a diversos grupos de insecticidas y los mecanismos bioquímicos implicados.
El muestreo de poblaciones de campo se realizó de forma dirigida sobre aquellas poblaciones de las zonas de Lleida y de Huesca que se encontraban en huertos donde el control había resultado difícil y, en ocasiones, había fracasado en mayor o menor medida.
Todas las poblaciones de carpocapsa fueron significativamente menos susceptibles que la población de referencia (una población española de laboratorio) a uno o varios de los insecticidas ensayados: los organofosforados etilclorpirifos, metilazinfos y fosalone y el análogo de la hormona juvenil fenoxycarb. Todas ellas mostraron una actividad de las oxidasas de función múltiple significativamente mayor que la de la población de referencia y la mayoría mostraron una actividad de las glutatión-S-transferasas significativamente mayor que la de la población de referencia. Ambos mecanismos están, por lo tanto, implicados en la resistencia.
En el caso de la psylla, se presentan los resultados obtenidos con el insecticida cipermetrín en poblaciones de campo y en una población de laboratorio seleccionada para la resistencia.
El nivel de resistencia de las poblaciones de campo es moderado, con una relación de resistencia máxima de 15. La selección en laboratorio durante solamente 4 generaciones provocó un aumento de la CL50 de 10 veces.
INTRODUCCIÓN
En este trabajo se presenta un resumen de los resultados obtenidos en un proyecto cuya finalidad es conocer la existencia de la resistencia de la carpocapsa, Cydia pomonella (L.) (Lepidoptera: Tortricidae), y de la psylla del peral, Cacopsylla pyri (L.) (Hemiptera: Psyllidae), a insecticidas y los posibles mecanismos bioquímicos implicados.
La detección de resistencia en poblaciones de campo es una parte integrante de todos los programas de control. Para el desarrollo de estrategias de manejo de la resistencia, hay que profundizar primero en el conocimiento de los mecanismos de resistencia presentes en cada especie, para luego estudiar la dinámica que presenta esta resistencia en las diversas poblaciones.
Los ensayos bioquímicos de evaluación de actividad enzimática son el método más seguro y rápido de detección de resistencia en campo, lo que es muy importante a la hora de planificación de estrategias de control adecuadas. Así mismo, los bioensayos de aplicación tópica con dosis diagnóstico de productos insecticidas permiten relacionar la actividad enzimática encontrada con un determinado grupo insecticida utilizando un número más pequeño de individuos. Al complementar los dos procedimientos, se puede encontrar la causa de la resistencia y desarrollar la forma de acción en campo para prevenirla con más información.
Resistencia de Cydia pomonella(L.) a organofosforados y Fenoxycarb
Introducción
La carpocapsa o agusanado de las manzanas y de las peras, C. pomonella, es una conocida y tradicional plaga de pomáceas y nogales cuyo control se basa principalmente en aplicaciones de insecticidas. Algunas poblaciones de Europa y de Estados Unidos han desarrollado resistencia a productos de diversos grupos químicos y funcionales, como organofosforados, piretroides, inhibidores de la síntesis de quitina y reguladores del crecimiento (RIEDL et al., 1985; MOFFIT et al., 1988; WELTER et al., 1991; SAUPHANOR et al., 2000, entre otros). La resistencia a insecticidas se debe a la acción de enzimas de detoxificación, tales como oxidasas de función múltiple (MFO), glutatión-S-transferasas (GST) y esterasas (EST), con especial importancia de los dos primeros grupos (SODERLUNDY BLOOMQUIST, 1991). En poblaciones francesas de C. pomonella resistentes a diflubenzurón y a deltametrín se ha demostrado la participación de los complejos de enzimas de detoxificación MFO y GST, pero no se ha citado hasta el momento la existencia de poblaciones con actividad de esterasas (SAUPHANOR et al., 1997; BOUVIER et al., 2002).
En la zona frutera de Lleida se habían realizado hasta el momento bioensayos de resistencia a metilazinfos sobre individuos de poblaciones de carpocapsa procedentes de diversas fincas con problemas en el control. Se detectó una disminución de la sensibilidad en alguna de las poblaciones de campo recogidas desde el año 1993 hasta 1998 (BOSCH et al., 1999). En cambio, se desconocen los mecanismos bioquímicos de resistencia involucrados, debido a lo cual, el objetivo principal de este estudio fue demostrar la posible existencia de poblaciones resistentes y encontrar los tipos de resistencia metabólica presentes en poblaciones naturales.
Material y métodos
Como el objetivo del trabajo no era evaluar la extensión de la resistencia, la recolección de poblaciones se realizó en siete huertos de manzano de la zona de Lleida seleccionados por técnicos de Agrupaciones de Defensa Vegetal (ADV) por haber tenido poblaciones altas de carpocapsa de difícil control. Las poblaciones de referencia, consideradas susceptibles a los insecticidas, fueron una población del Centre INRA (Institut Nacional de la Recherche Agronomique), Unitè d?Ecologie des Invertébrés. Domaine St-Paul, Avignon (Francia) y una del laboratorio de Entomología Agrícola del Área de Protección de Cultivos del Centro UdL-IRTA de R+D de Lleida, mantenida desde 1993 sin exposición a insecticidas.
Los insecticidas ensayados fueron los organofosforados etilclorpirifos, fosalone y metilazinfos y el análogo de la hormona juvenil fenoxycarb.
Los bioensayos sobre larvas en diapausa se realizaron mediante aplicaciones tópicas, en la región medio dorsal de las larvas, de 1 ?L de una solución de la materia activa en acetona cuya concentración era la CL99 de la población de referencia francesa, denominada concentración diagnóstico (BOUVIER et al., 1995) o de acetona pura. Las concentraciones fueron 1.200 mg/L de etilclorpirifos, 3.000 mg/L de fosalone, 600 mg/L de metilazinfos y 1 mg/L de fenoxycarb. Se utilizaron 80 larvas por localidad como mínimo. Inmediatamente después del tratamiento, las larvas fueron colocadas a 25±1ºC, 40±10% de humedad relativa y fotoperíodo 16:8 (L:O) en placas petri de 90 mm de diámetro, en cuyo interior se depositaron trozos de cartón corrugado (20 x 20 mm). Las placas fueron observadas a diario la emergencia del último adulto. La mortalidad observada se corrigió con la del testigo mediante la fórmula de Abbot (1925) y la mortalidad corregida se sometió a un análisis de varianza y posterior separación de medias mediante la prueba de Rangos Múltiples de Duncan (P<0,05).
La actividad enzimática se midió sobre larvas en diapausa y adultos, utilizando la metodología propuesta por Bouvier et al. (2002), cuyas características más importantes se presentan en el Cuadro 1. Se compararon mediante prueba de contrastes la actividad de las poblaciones susceptibles entre sí y la actividad de las poblaciones de campo con la de la población de referencia de Lleida.
Parte del trabajo se realizó en el Centre INRA (Institut Nacional de la Recherche Agronomique), Unitè d?Ecologie des Invertébrés. Domaine St-Paul, Avignon (Francia).
Resultados y discusión
La población susceptible de referencia (S_Lleida) mostró una elevada susceptibilidad a todos los insecticidas ensayados, con una mortalidad superior al 85% en las concentraciones diagnóstico utilizadas (Cuadro 2). Las mortalidades observadas son similares a las citadas para poblaciones sensibles de Francia (Bouvier et al., 1995) y Suiza (PASQUIER Y CHARMILLOT, 2004).
La mortalidad de las larvas de todas las poblaciones de campo fue significativamente menor que la de la población susceptible S_Lleida (Cuadro 2). La mortalidad máxima observada respecto a la de la población S_Lleida correspondió a un 8,9% (etilclorpirifos), un 47,5% (metilazinfos), un 34,3% (fosalone) y un 68,7% (fenoxycarb), lo que muestra que la disminución de la susceptibilidad ha sido menor en el caso del fenoxycarb. En los historiales de tratamientos de las parcelas, predomina el uso de organofosforados y sólo en una de ellas se aplicó fenoxycarb. La aplicación repetida del mismo insecticida contra diferentes generaciones de la plaga el mismo año es una de las causas más importantes de la aparición de resistencias. Por ejemplo, Knigth et al. (1994) encontraron que los niveles de resistencia eran claramente superiores en huertos con más de 4 aplicaciones de metilazinfos por campaña. No hay que olvidar, sin embargo, la posibilidad de desarrollo de resistencias cruzadas. Así, Sauphanor et al. (1999) encontraron en una población seleccionada con deltametrina, patrones de resistencia cruzada con metilazinfos y fosalone y Welter et al. (1991) observaron resistencia cruzada con fenoxycarb en una población de laboratorio seleccionada con metilazinfos.
De los tres sistemas enzimáticos involucrados en la detoxificación de insecticidas, la actividad de las esterasas sólo se midió en larvas en diapausa de una población de campo (Poal_1) y de S_Lleida, trabajos realizados en el Centre INRA (Institut Nacional de la Recherche Agronomique), Unitè d?Ecologie des Invertébrés. Domaine St-Paul, Avignon (Francia). La actividad de las esterasas en la población de campo fue significativamente mayor que en S_Lleida (4,26 ± 0,46 vs. 1,42 ± 0,10 mol 2-naftol · mg proteína-1 · min-1, respectivamente. F=3,85; P<0,001). Esta actividad esterásica no ha sido citada hasta el momento en poblaciones europeas, pero sí en poblaciones de los EE UU (BUSH et al., 1993).
La actividad de las MFO y de las GST de la población S_Lleida no fue significativamente diferente de la actividad de S_Avignon (Cuadro 3). La población susceptible S_Lleida proviene de la cría de carpocapsa en el laboratorio del Centro UdL-IRTA de R+D, desde 1993, mientras que S_Avignon es la población de referencia de muchos de los trabajos publicados en Francia. El inicio de ensayos bioquímicos de resistencia metabólica en poblaciones españolas hacía necesaria la comparación de la actividad de ambas poblaciones. Los resultados obtenidos muestran que S_Lleida puede considerarse la referencia de las poblaciones Cinco poblaciones de carpocapsa (Alcarràs_1, Alcarràs_2, Bellpuig, Menàrguens y Poal_2) fueron utilizadas en los bioensayos de aplicación tópica de concentraciones diagnóstico y en los de actividad de MFO y GST, únicas vías de detoxificación enzimática de insecticidas encontrada en poblaciones europeas de carpocapsa (SAUPHANOR et al., 1997; BOUVIER et al., 2002). Todas ellas mostraron una mortalidad menor que la de S_Lleida en los bioensayos con metilazinfos, fosalone y fenoxycarb y una sobre expresión enzimática de MFO, por lo que la elevada actividad de detoxificación de MFO puede estar relacionada con la falta de efectividad de estos productos. Tres de ellas mostraron además una actividad de GST mayor que la de S_Lleida, por lo que el mecanismo de detoxificación de GST también está actuando como vía de resistencia fisiológica. Para probar cuál es el mecanismo implicado, se realizarán ensayos con inhibidores de la actividad de ambos complejos de enzimas.
No debe deducirse de estos resultados que la resistencia a insecticidas está presente en todas las poblaciones de carpocapsa de la zona de Lleida, ya que se ha realizado un muestreo totalmente dirigido a encontrar las poblaciones resistentes que pudiesen existir. Sin embargo, estos trabajos son importantes porque la detección temprana de problemas de resistencia en campo es fundamental para un adecuado manejo de la misma, mediante el uso restringido de los insecticidas (utilizando confusión sexual antes de la aparición de los problemas) y la rotación de insecticidas entre generaciones y años.
Resistencia de Cacopsylla pyri(L.) a cipermetrín
Introducción
Al contrario que carpocapsa, la psylla del peral, C. pyri, no es una plaga tradicional de este cultivo. Los primeros problemas graves que provocó tuvieron lugar en Italia y en Francia en los años 70 (ARZONE 1979; ATGER, 1979), mientras que en España, se detectaron en la primera mitad de los años 80. Actualmente, es una plaga clave del peral y para su control sólo se dispondrá, tras la retirada del amitraz, de un pequeño grupo de insecticidas (piretroides, abamectina y fenoxycarb), que se utilizan varias veces durante la campaña. Las primeras citas de falta de control en campo fueron realizadas por Atger en 1979 y Stäubli y Antonin en 1984 y fueron seguidas por trabajos más precisos en los que se detectaron poblaciones resistentes en diferentes estados de desarrollo a organofosforados y piretroides en Francia (BUES et al., 1996 y 2003, entre otros) y en Suiza (SCHAUB et al., 1997 y 2001, entre otros)
El insecticida cipermetrín es utilizado en prefloración contra adultos invernantes, mezclado o no con aceites blancos, y en el período vegetativo contra otras plagas, por lo que es posible que sea utilizado en la misma campaña en más de una ocasión en la misma parcela. Por ello, se ha estudiado la susceptibilidad de adultos de diferentes poblaciones.
Para comprobar la posibilidad de que las poblaciones de psylla desarrollen resistencias y estudiar sus posibles mecanismos, se seleccionó una población en laboratorio con el objetivo de aumentar su
resistencia.
Material y métodos La recolección de los adultos se realizó en 12 parcelas de peral de las zonasde Lleida y de Huesca, seleccionadas por técnicos de Agrupaciones de DefensaVegetal (ADV) por haber tenido poblaciones altas de psylla de difícil control yen una parcela sin tratamientos insecticidas en los últimos 10 años.
Los adultos se recogieron por golpeo en las campañas 2003-04 y 2004-05 durante otoño-invierno. La metodología utilizada fue la aplicación tópica de una gota de 0,5 ?L de una solución de cipermetrín (Afrisect 10 EC, Lainco) en alcohol (40%) sobre adultos anestesiados mediante CO2 y frío. Una vez tratados, los adultos se mantuvieron en tubos de vidrio en una cámara húmeda a 24±1ºC y 16:8 (L:O). Se utilizaron de 6 a 10 concentraciones del producto y se realizaron un mínimo de 4 repeticiones de 10 individuos por concentración. La mortalidad se evaluó a las 24 h y los resultados se analizaron mediante un análisis Probit.
La selección de la población resistente se realizó mediante la aplicación, durante 4 generaciones, de concentraciones de cipermetrín que provocasen una mortalidad de 40-60%. El análisis de la susceptibilidad se realizó en la octava generación; es decir, después de 4 generaciones sin estar expuesta al insecticida, debido a que el número de individuos de la población fue demasiado bajo para realizar los ensayos antes de ella.
Resultados y discusión
La Figura 1 muestra la distribución de frecuencias de la mortalidad provocada por la máxima concentración recomendada en campo (0,1 mL de m.a./L).
En el 83 % de las poblaciones analizadas, esta concentración provocó una mortalidad inferior al 80 %, con tres poblaciones cuya mortalidad fue inferior al 50 %, y en ningún caso provocó una mortalidad del 100%. Hay por lo tanto, un problema de susceptibilidad de poblaciones de C. pyri a cipermetrín, ya que la eficacia de la máxima concentración recomendada no fue la esperada.
La Figura 2 muestra las CL50 de las poblaciones analizadas durante las dos campañas. En el 77 % de los casos, la CL50 estuvo comprendida entre 0,05 y 0,1 mL de m.a./L y en dos poblaciones los valores fueron inferiores al mínimo del rango (0,02 y 0,03 mL de m.a./L). Una población (Aitona1) mostró en las dos campañas niveles de susceptibilidad muy inferiores a todas las poblaciones (con un Ratio de Resistencia de 15 respecto a la población más susceptible en la campaña 2004-2005). Este hecho se puede explicar por el gran numero de tratamientos con piretroides utilizados en esta parcela durante las ultimas campañas (7, entre enero y diciembre de 2004).
Los valores de las CL50 obtenidos son muy parecidos a los que obtuvieron Buès et al. (1999). La CL50 de una población sensible de laboratorio fue 0,035 mL de m.a./L, comparable con las dos CL50 más bajas de Lleida, y la de poblaciones cerca de Avignon se encontraban entre 0,1 y 0,2 mL m.a./L españolas naturales que se analizarán a continuación y en estudios posteriores en este ámbito.
La actividad de MFO de todas las poblaciones de campo fue significativamente mayor que la de S_Lleida, mientras que la actividad de GST de 5 de las 7 poblaciones de campo fue significativamente mayor que la de S_Lleida (Cuadro 3). Los ratios de actividad se encontraron en los rangos de 13,3 a 24,4 (MFO) y de 1,9 a 4,8 (GST). La actividad en términos relativos de las MFO en las poblaciones españolas de C. pomonella es, por lo tanto, mayor que la de las GST.
En poblaciones francesas resistentes a tebufenocida, diflubenzurón y deltametrín, los valores de la actividad de MFO en larvas fueron siempre superiores a los registrados por las cepas susceptibles, con tasas (R/S) entre 3,8 y 65,07 (SAUPHANOR et al., 1999; BOUVIER et al., 2002, entre otros) y los valores de actividad de GST en adultos de poblaciones resistentes a diflubenzuron y deltametrín fueron mayores que los de S_Avignon (SAUPHANOR et al., 1997; BOUVIER et al., 2002), por lo tanto, todas las poblaciones españolas analizadas presentan tasas de actividad consideradas resistentes para carpocapsa.
Un aspecto importante para el manejo de la resistencia es el porcentaje de adultos sensibles y resistentes de las poblaciones. Un análisis de la distribución de frecuencias de la actividad enzimática de MFO y de GST de S_Lleida y de las poblaciones de campo, no presentado en la presente publicación por falta de espacio, muestra que el porcentaje de individuos de cada población de campo cuya actividad de MFO es igual o menor que la máxima observada en MFO es pequeño. En cambio, en el caso de la actividad GST es mayor. Si la resistencia fuese debida principalmente a la acción de la MFO, la reversión de la resistencia sería más difícil.
Las rectas de regresión mortalidad (probit) - concentración (log) de la población inicial y de la seleccionada con cipermetrín fueron paralelas (chi cuadrado = 0,16; g.l. = 1; P = 0,685). La selección mediante cipermetrín condujo a una población cuya CL50 fue significativamente distinta de la CL50 de la población inicial (0,530 frente a 0,051 mL m.a./L) y mayor que cualquiera de las observadas en las poblaciones de campo.
En estos momentos el nivel de resistencia en campo respecto a cipermetrín muestra valores moderados, pero los bajos valores de susceptibilidad obtenidos en algunas poblaciones de campo y los obtenidos al seleccionar una población en laboratorio únicamente con 4 generaciones hacen pensar en la problemática que puede presentarse en un futuro debido al posible uso reiterado de piretroides.
Agradecimientos: Los autores agradecen a B. Sauphanor, T. Boivin y J. Bouvier (Centre INRA (Institut Nacional de la Recherche Agronomique), Unitè d?Ecologie des Invertébrés. Domaine St-Paul, Avignon (Francia)) su constante ayuda en la implementación y puesta a punto de la metodología utilizada, a J. Safont, I. Romero y R. Vaquera la asistencia técnica prestada, a J. García de Otazo y R. Torà (DARP, Gencat) la ayuda en la localización de parcelas y a numerosos técnicos de Agrupaciones de Defensa Vegetal la colaboración prestada en todo momento.
Estos trabajos han sido parcialmente financiados por los proyectos RTA01- 079, AGL2001-1201, AGL2004-05812/AGR y por el Departament d?Agricultura, Ramaderia i Pesca de la Generalitat de Catalunya. M. Rodriguez es beneficiaria de una beca BID de Comisión Nacional de Ciencia y Tecnología (CONICYT)- Chile. X. Miarnau es beneficiario de una beca de la Comisión Interministerial de Ciencia y Tecnología (CICYT).
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