Sección: 16º symposium internacional sobre la problemática actual de las resistencias en cultivos mediterráneos
La resistencia de los hongos a los fungicidas es un problema importante que hay que tener en cuenta en el control de enfermedades. La resistencia se desarrolla más rápidamente en enfermedades policíclicas, en las que es necesario realizar muchos tratamientos durante el ciclo vegetativo, y cuando los fungicidas utilizados tienen un modo de acción regulado por un solo gen. Un ejemplo clásico en el que se dan estas dos características es el del control de Botrytis cinerea en plantas hortícolas, tema del que trata esta comunicación, que además supone un grave problema para la horticultura intensiva española.
Los cultivos bajo plástico son una de las principales fuentes de riqueza del sureste español donde se encuentra un 47% del área nacional destinada a producción de hortícolas en invernadero. Una de las enfermedades más importantes de los cultivos hortícolas de invierno (tomate, berenjena, pepino, pimiento, calabacín y judía verde) bajo plástico es la podredumbre gris causada por el hongo Botrytis cinerea (Figura 1). Las condiciones ambientales que se dan en estos invernaderos hacen que esta enfermedad sea una de las más graves y, según los agricultores de la zona, una de las más difíciles de controlar.
El control de la enfermedad se lleva a cabo fundamentalmente por métodos químicos siendo el grupo de las dicarboximidas (procimidona, vinclozolina e iprodiona) con mucho el más utilizado, seguido de los benzimidazoles (benomilo, carbendacima y metiltiofanato) y otros fungicidas de amplio espectro como diclofluanida y clortalonil. Se utiliza también la mezcla de carbendacima y dietofencarb (bencimidazol + N-fenilcarbamato), y anilinopirimidinas (pirimetanil y ciprodinil). Actualmente se han introducido fungicidas con nuevos modos de acción como los fenilpirroles (fludioxonil). Los agricultores aplican los fungicidas semanalmente, sobre todo en los momentos de mayor riesgo de la enfermedad.
Cabello y Cañero (1994) calcularon que el coste medio total del control químico en los invernaderos de Almería suponía un 16,5% del coste total de producción.
En un 30% de los invernaderos de tomate y pepino la eficiencia de éste control químico (pts/kg cosecha), según este estudio, estaba por debajo del 50%.
Una de las causas a las que podía deberse la baja eficacia del control químico en los invernaderos de Almería, así como que las epidemias fueran incontrolables cuando las condiciones son favorables para su desarrollo, era la presencia de cepas resistentes a fungicidas en la población de B. cinerea. Esto nos llevó a estudiar el problema de la resistencia de B. cinerea a fungicidas como posible causa del fallo de control de la enfermedad causada por el hongo.
Se realizaron tres muestreos de toda la provincia de Almería al comienzo de las epidemias de las campañas de 1992-93, 1995-96 y 1999-2000 para estimar la frecuencia de aislados resistentes a bencimidazoles, dicarboximidas, N-fenilcarbamatos y anilinopirimidinas en B. cinerea y su evolución. Durante la campaña de 92-93 se muestrearon 49 invernaderos recogiéndose 261 aislados; en la campaña 95-96, 31 invernaderos obteniéndose 154 aislados y 307 aislados en 99-00 de 47 invernaderos. La resistencia a bencimidazoles, dicarboximidas y N-fenilcarbamatos se determinó midiendo la capacidad de cada aislado de crecer en presencia de carbendacima (1 mg/l), procimidona (5 mg/l), dietofencrb (5 mg/l), la mezcla de carbendacima y dietofencarb (6 mg/l, 1:5) y pirimetanil (0,7 mg/l) (Figura 2). La situación encontrada fue alarmante (RAPOSO y col. 1996).
La frecuencia de aislados resistentes a bencimidazoles y dicarboximidas era la más alta alcanzando valores del 47% ya en la campaña 92-93, que aumentaban hasta 70% en 95-96 y 99-00. La frecuencia de aislados resistentes a estos dos grupos de fungicidas y además a los N- fenilcarbamatos también aumentaba a lo largo del tiempo llegando a 14% en 99-00. En cuanto a la resistencia a bencimidazoles aumentaba desde 63% en 92-93, hasta 81% en 95-96, alcanzando niveles del 90% en 99-00; a dicarboximidas desde 56.7% en 92-93, hasta 84% en 95-96 y 77% en 99-00; y a N-fenilcarbamatos desde 1.2% en 1992, a 4% en 1995 y 23% en 2000 (Figura 3, Tabla 1). En la campaña 99-00 se realizó también una evaluación de la resistencia a anilinopirimidinas, obteniéndose 12% de aislados resistentes, solamente 4 años más tarde de haber sido introducido este grupo de fungicidas en la zona (MOYANO y col., 2004). Un 3% de los aislados tenían resistencia múltiple a bencimidazoles, dicarboximidas, N-fenilcarbamatos y anilinopirimidinas.
Con algunos de estos aislados se realizaron experimentos in vivo para ver la correspondencia con la resistencia cualitativa mostrada anteriormente. Para ello se recogieron cotiledones de plantas de pepino crecidas en invernadero que habían sido previamente tratados con los fungicidas benomilo (Zetamilo 50WP, ICI-Zeltia, 1 g/l), iprodiona (Rovral 50PM, Rhône-Poulenc, 1,5 g/l), carbendacima + dietofencarb (Sumiplan PM. Agrocross SA, 1,5 g/l) y pirimetanil (Scala, Leverkusen, 2g/l). Los cotiledones se inocularon con B. cinerea y se incubaron a 22ºC en oscuridad observándose a los 6 dias la podredumbre. Los resultados mostraron una total correspondencia entre aislados resistentes y sensibles en ensayos in vitro e in vivo (RAPOSO y col., 1996, MOYANO y col., 2004).
Un aspecto importante a considerar para desarrollar una estrategia adecuada de control de la podredumbre gris es conocer la fitness de los aislados resistentes a fungicidas. Si se asocian costes de fitness con resistencia a un fungicida, la frecuencia de aislados resistentes disminuirá en ausencia del fungicida.
Además, una práctica habitual para evitar el aumento de aislados resistentes a fungicidas en una población es la aplicación de fungicidas con distinto modo de acción en mezclas o alternados. La alternancia será más eficaz que la mezcla en caso de que existan costes de fitness asociados a la resistencia en los fungicidas usados. Nosotros tratamos de ver la relación existente entre componentes de fitness relacionados con el ciclo parasítico del patógeno (como desarrollo de la lesión y esporulación, fitness parasítica) y relacionados con la fase no patogénica (como la capacidad de supervivencia, fitness saprofítica) y la resistencia a bencimidazoles, dicarboximidas y anilinopirimidinas. Los componentes de fitness parasítica de los aislados se midieron en discos de hojas de pepino inoculados con aislados sensibles y resistentes a cada fungicida. Los componentes de fitness saprofítica se midieron viendo la viabilidad de esclerocios y micelio (muestras de tomate inoculadas artificialmente) colocados en invernaderos de Almería durante el verano. La resistencia a cada fungicida se evaluó determinando la dosis que reducía el crecimiento de cada aislado al 50% (EC50). Finalmente se establecieron correlaciones entre estos valores mediante los coeficientes de correlación de rangos de Spearman. Los resultados mostraron que no había costes de fitness parasítica asociados a la resistencia a dicarboximidas, bencimidazoles y anilinopirimidinas (RAPOSO y col., 1996; MOYANO y col., 2004). La fitness saprofítica solo se estudió para dicarboximidas y, en este caso, se vió que los esclerocios de los aislados resistentes sobrevivían menos tiempo que los de los aislados sensibles, no ocurriendo esto con el micelio (RAPOSO y col., 2000).
La situación descrita aquí muestra que los métodos de control utilizados contra la podredumbre gris en los cultivos hortícolas de Almería, basados mayoritariamente en la aplicación de fungicidas, no son los apropiados: la población del hongo se hace cada vez más resistente a los fungicidas utilizados e incluso los nuevos fungicidas tienen alto riesgo de desarrollar poblaciones resistentes.
Queda clara la necesidad de disponer de una estrategia de lucha más eficaz contra B. cinerea en la que se integren métodos de control distintos de los químicos. Basada en los resultados presentados aquí, esta estrategia no debe asumir costes de fitness asociados a resistencia a bencimidazoles y anilinopirimidinas.
En el caso de las dicarboximidas hay que considerar que la supervivencia de esclerocios es menor en los aislados resistentes. Sin embargo, trabajos realizados por nuestro grupo demostraron que, en Almería, la importancia de los esclerocios en la supervivencia del hongo no es alta, siendo el micelio la forma en que B. cinerea pasa el verano.
Es importante a qué escala deben realizarse las medidas de control. Para ello se debe saber en qué medida se mueve el inóculo. La forma más importante de dispersión de B. cinerea es por conidias transportadas por el aire. Si cada invernadero es independiente, las medidas de control que se utilicen en él no incidirán en el resto. Si por el contrario el inóculo se mueve entre invernaderos, la influencia entre el control de invernaderos será grande. Para ver la relación entre las poblaciones de B. cinerea entre y dentro de cada invernadero se estudió la estructura de la población mediante marcadores moleculares RAPD y AFLP (ALFONSO y col., 2000; MOYANO y col., 2003). Los resultados mostraron que la diversidad genética dentro de los invernaderos suponía un 96% de la diversidad total, siendo solo el 4% la diversidad genética entre ellos (Tabla 2). La estimación del número de migrantes entre invernaderos (siempre mayor de uno) indicó la importancia de la migración en evitar al diferenciación genética (Tabla 2). Se construyeron también dendrogramas con el método UPGMA, basados en el coeficiente de similitud de Dice (1945). Estos dendrogramas mostraron que los aislados no se agrupaban ni por invernadero, ni por huésped, ni por resistencia a fungicida (excepto el fenotipo sensible a bencimidazoles y resistente a dicarboximidas. Estos resultados sugieren que las estrategias de lucha a seguir en el control de B. cinerea en Almería deben tomarse a nivel regional, puesto que el manejo de cada invernadero incide en el resto.
Agradecimientos: Agradecemos la financiación recibida a INIA (proyecto RTA01-0033) y a FIAPA (proyecto 97/B3/146). C. Moyano disfrutó de una becaria de INIA y José Delcán de una beca FPI del Ministerio de Educación y Ciencia. Agradecemos la ayuda recibida de C. Simón, T. Urrutia, O. López Montoya, M.D. Alferez-García y M.M. Martínez-Narvaez.
BIBLIOGRAFÍA
ALFONSO C, RAPOSO R, MELGAREJO P. 2000. Genetic diversity in Botrytis cinerea populations on vegetable crops in greenhouses in southeastern Spain. Plant Pathology 49:243-251.
CABELLO T, CAÑERO R. 1994. Technical efficiency of plant protection in Spanish greenhouses. Crop Protection 13:153-159.
DICE LR. 1945. Measures of the amount of ecological association between species. Ecology 26: 297-302.
MOYANO C, ALONSO C, GALLEGO J, RAPOSO R, MELGAREJO P. 2003. Comparison of RAPD and AFLP marker analysis as a means to study genetic structure of Botrytis cinérea populations. European Journal of Plant Patholgoy 109: 515-522.
MOYANO C, GÓMEZ V, MELGAREJO P. 2004. Resistance to pyrimethanil and other fungicides in Botrytis cinerea populations collected on vegetable crops in Spain. Journal of Phytopathology 152: 484-490.
RAPOSO R, DELCAN J, GÓMEZ V, MELGAREJO P. 1996. Distribution and fitness of isolates of Botrytis cinerea with multiple fungicide resistance in spanish greenhouses. Plant Pathology 45:497-505.
RAPOSO R, GÓMEZ V, URRUTIA T, MELGAREJO P.L 2000. Fitness of Botrytis cinerea associated with dicarboximide resistance. Phytopathology 90: 1246-1249.
