Sección: 16º symposium internacional sobre la problemática actual de las resistencias en cultivos mediterráneos
Cuando se emplea de modo excesivo un fungicida determinado, más pronto o más tarde, nos encontraremos con hongos resistentes a ese producto. Por lo general, las cepas resistentes ya existen en la población, de manera que mediante el uso del fungicida lo que hacemos es seleccionarlas. Podemos considerar que la aparición de resistencias a fungicidas se inicia a partir de los años 60, cuando comienzan a comercializarse los fungicidas con sitios de acción específicos. Con anterioridad, los fungicidas empleados eran los llamados multisitio, que actúan sobre varias dianas celulares simultáneamente y frente a los cuales no se ha detectado resistencia.
En este trabajo veremos una panorámica general de los mecanismos de actuación de fungicidas registrados con actividad antioídio, con algo más de detalle el modo de acción de las estrobilurinas y de los fungicidas inhibidores de la biosíntesis de ergosterol y finalmente, discutiremos algunos datos sobre frecuencias de resistencia a estos dos tipos de fungicidas en Podosphaera fusca, el agente causal de oídio de las cucurbitáceas, en las principales zonas de cultivo de cucurbitáceas de la mitad sur de España en los últimos años.
Mecanismos de acción de los fungicidas
Los fungicidas se suelen agrupar atendiendo a sus mecanismos de actuación, que son muy variados, ya que actúan sobre distintos procesos bioquímicos o fisiológicos de los hongos. Estos mecanismos son relativamente independientes de su estructura química, puesto que fungicidas que pertenecen a grupos estructurales diferentes pueden actuar sobre una misma diana metabólica o de biosíntesis de un compuesto determinado. En la página web del FRAC (http://www.frac.info), puede obtenerse una lista de fungicidas ordenados por mecanismos de actuación, que resumimos aquí para centrarnos en los que tienen actividad antioídio y han sido autorizados tal y como aparece recogido en el Registro de Productos Fitosanitarios del MAPA (http://www.mapya.es/es/agricultura/pags/fitos/registro/menu.asp), con objeto de ver las diferentes herramientas de las que podemos disponer para luchar contra este tipo de enfermedades. Los fungicidas antioídio, con independencia del cultivo o cultivos sobre los que estén autorizados, se engloban en los siguientes grupos de actuación:
A) Síntesis de ácidos nucleicos. Como antioídios destacan las hidroxi (2- amino) pirimidinas (bupirimato), que actúan inhibiendo adenosin deaminasa (ADA) y cuyo efecto se traduce en la inhibición de la síntesis de ADN. El riesgo de aparición de resistencias frente a este grupo es medio.
B) Mitosis y división celular. Destacan los metil bencimidazol carbamatos (MBC). Pertenecen a este grupo bencimidazoles (carbendazima) y tiofanatos (tiofanato y metil tiofanato) que inhiben el ensamblaje de las subunidades de ß-tubulina en la mitosis. Presentan un riesgo de aparición de resistencia alto.
C) Respiración. Una familia importante dentro de este grupo está formada por los fungicidas llamados estrobilurinas o QoI ("Quinone Outside Inhibitors"), que inhiben el complejo mitocondrial citocromo bc1 (complejo III) de la cadena respiratoria. En este apartado señalaremos los oximino acetatos (kresoxim- metil y trifloxistrobin), los metoxi-acrilatos (azoxistrobin) y los metoxi-carbamatos (piraclostrobin). El riesgo de aparición de resistencia es alto. Otra familia en este grupo de fungicidas relacionados con la respiración está formada por los dinitrofenoles (dinocap), que actúan desacoplando la fosforilación oxidativa. Frente a este grupo no se ha detectado resistencia.
E) Mecanismos de transducción de señales. Aquí encontramos las quinolinas (quinoxifén), con riesgo medio de aparición de resistencias.
- Biosíntesis de esteroles de membranas. Es el grupo más importante de fungicidas antioídio. Un primer grupo de estos compuestos son los que actúan inhibiendo la biosíntesis de ergosterol (fungicidas IBE), un esterol que forma parte de las membranas de las células fúngicas. Comprende a los fungicidas inhibidores de la enzima esterol C14á-demetilasa, que cataliza la demetilación del C14 en la síntesis del ergosterol, y que reciben el nombre de inhibidores de la demetilación o DMI ("DeMethylation Inhibitors"). En este grupo se encuentran las siguientes familias: piperacinas (triforina), piridinas (pirifenox), pirimidinas (fenarimol, nuarimol), imidazoles (imazalil, triflumizol, procloraz) y triazoles (bitertanol, ciproconazol, diniconazol, fenbuconazol, fluquinconazol, flusilazol, flutriafol, hexaconazol, miclobutanil, penconazol, propiconazol, tebuconazol, tetraconazol, triadimefón y triadimenol).
Presentan un riesgo de aparición de resistencias medio y se han detectado resistencias cruzadas entre fungicidas pertenecientes a este grupo de los DMI. Una segunda clase de fungicidas dentro de los IBE está formada por los inhibidores de esterol _14-reductasa y esterol _8,7-isomerasa también en la biosíntesis de ergosterol. Pertenecen a esta clase morfolinas (fempropimorf) y piperidinas (fenpropidin). Tienen un riesgo de aparición de resistencia bajo-medio y se han detectado resistencias cruzadas entre fungicidas de esta clase pero no con los DMI.
H) Síntesis de glucanos y pared celular. En este epígrafe se incluyen inhibidores de quitina sintasa como los peptidil pirimidina nucleósidos (polioxinas). Presentan un riesgo de aparición de resistencia medio.
M) Acción multisitio. Comprende a los ditiocarbamatos (maneb, mancozeb y ziram), ftalimidas (captan, folpet) y cloronitrilos (clortalonil). No son fungicidas de acción específica antioídio, sino que tienen un amplio espectro de acción. Se considera que tienen un riesgo bajo de aparición de resistencia y no se han descrito resistencias cruzadas entre los distintos grupos.
Finalmente, existen otros fungicidas antioídio de difícil clasificación o de mecanismo de acción desconocido. En este apartado indicaremos quinoxalinas (quinometionato) y compuestos inorgánicos como azufre y permanganato potásico.
Estrobilurinas; mecanismo de acción y resistencia
Las estrobilurinas son una importante clase de fungicidas de uso agrícola. Su descubrimiento estuvo inspirado en un grupo de fungicidas de origen natural derivados del ácido ß-metoxiacrílico. El mecanismo de acción de las estrobilurinas se basa en la inhibición de la respiración, deteniéndose entre otras funciones básicas celulares, las síntesis de proteínas, ARN y ADN, debido a una deficiencia en ATP. La diana de de las estrobilurinas se localiza en el complejo mitocondrial citocromo bC1 (complejo III), concretamente se unen al citocromo b de este complejo, cerca del centro Qo y de la ferrosulfoproteína de Rieske, de ahí que estos compuestos también se conozcan con el nombre de inhibidores Qo (QoI). Las estrobilurinas actúan bloqueando la transferencia de electrones entre el citocromo b y el citocromo c1, y por tanto, interrumpiendo el flujo de electrones hacia el complejo terminal de la citocromo c oxidasa, lo que a su vez destruye la fuerza protón-motriz generada por ambos complejos. Todo ello se traduce en la reducción de la producción de ATP. Además, el bloqueo de la respiración genera electrones en estado de alta energía que provocan una rápida aparición de especies reactivas de oxígeno como el peróxido de hidrógeno, que hacen que las estrobilurinas tengan actividad fungicida.
El mecanismo más importante que confiere resistencia a estrobilurinas es el producido por mutaciones puntuales, simples o combinadas, en el gen de citocromo b (cytb), que se localizan en dos regiones extramembranales del complejo enzimático citocromo bc1, desde los aminoácidos 127-147 y 275-296. No obstante, las sustituciones más frecuentes y que confieren los niveles más altos de resistencia a estrobilurinas son las sustituciones de glicina por alanina en la posición 143 (G143A) y de fenilalanina por leucina en la posición 129 (F129L).
Estas mutaciones puntuales en el gen cytb son las responsables de la resistencia cruzada que se observa frente a las estrobilurinas y la base de los sistemas de diagnóstico rápido de la resistencia a QoIs. Un segundo mecanismo que confiere resistencia a estrobilurinas es la inducción de una respiración alternativa en la que está implicada una enzima denominada oxidasa alternativa (AOX), no obstante, el papel de esta oxidasa alternativa en la resistencia a estrobilurinas en campo está sometido a debate.
Fungicidas inhibidores de la biosíntesis de ergosterol; mecanismo de acción y resistencia
Los inhibidores de la biosíntesis de ergosterol (IBE) forman un extenso grupo de fungicidas sistémicos, la mayoría de amplio espectro, y que en función de su mecanismo de acción se clasifican en cuatro tipos distintos, aunque sólo uno de ellos, el grupo que forman los inhibidores de esterol C14á-demetilasa (DMI), está registrado actualmente como antioídio. Una de las enzimas clave de la ruta de biosíntesis de ergosterol es esterol C14a-demetilasa, que es la diana de los fungicidas DMI. La inhibición de CYP51 por los DMI provoca la acumulación de eburicol en hongos filamentosos. Este precursor de la biosíntesis de ergosterol puede pasar a ser sustrato de esterol C14-reductasa, una enzima de esta misma ruta que transforma eburicol en 14á-metilfecosterol. Esta molécula puede sustituir al ergosterol en la membrana plasmática ya que prácticamente presenta las mismas características que este último. Esto es, de hecho, lo que ocurre en un gran número de cepas resistentes a los DMI. En las cepas sensibles, otra enzima, esterol _5,6-desaturasa, puede actuar sobre el 14á-metilfecosterol transformándolo en 14á-metil-3,6-diol, debido a un intento fallido de introducir un doble enlace en los C5 y C6, ya que su auténtico sustrato es el episterol, un derivado del fecosterol. La acumulación de 14á-metil-3,6-diol es incompatible con la vida debido a que provoca un trastorno en la estructura de la membrana plasmática como consecuencia de la repulsión que se establece entre el segundo grupo polar de la molécula y las colas hidrofóbicas de los fosfolípidos de membrana. Sin embargo, en algunos de los aislados resistentes no ocurre esto, ya que esterol _5,6-desaturasa, debido a algún tipo de modificación, no puede catalizar el paso de 14á-metilfecosterol a 14á-metil-3,6-diol y el primero de éstos reemplaza al ergosterol en la membrana plasmática permitiendo el normal funcionamiento de la célula (Figura 1).
El fenómeno de resistencia a fungicidas DMI es bastante complejo. Esta resistencia es debida, en la mayoría de los casos, a que en el hongo en cuestión se dan una o varias de las siguientes situaciones: 1) alteraciones en la molécula diana (C14á-demetilasa) debido fundamentalmente a mutaciones en la secuencia del gen codificante CYP51; 2) mecanismos de expulsión de tóxicos (transportadores ABC); 3) mecanismo supresor que permite el crecimiento a partir de esteroles metilados en C14; 4) sobreexpresión de la enzima esterol C14á-demetilasa debido a mutaciones en regiones del promotor de CYP51; 5) disminución de la permeabilidad de la membrana del hongo al fungicida; y 6) mecanismos de degradación de tóxicos. Los tres primeros son los más importantes en cuanto a la contribución a la resistencia se refiere y los que suelen aparecer en los casos en los que los niveles de resistencia son más altos, o bien cuando se producen fenómenos de resistencia cruzada entre fungicidas pertenecientes a familias químicas distintas de DMIs.
Resistencia a estrobilurinas y a fungicidas DMI en oídio de cucurbitáceas
El cultivo de cucurbitáceas constituye una importante actividad económica en nuestro país. Una de las principales patologías de origen fúngico que afectan a estos cultivos, no sólo en España sino en el resto del mundo, es el oídio. La enfermedad se caracteriza por la aparición sobre las hojas de pequeñas manchas circulares de color blanquecino y aspecto pulverulento (Figura 2), que conforme avanza la enfermedad llegan a cubrir completamente las hojas y a extenderse hacia otras partes aéreas de la planta. Las hojas fuertemente afectadas presentan clorosis, y finalmente adquieren una tonalidad marrón y se secan, de esta forma las plantas mueren prematuramente. En ataques severos, el oídio de las cucurbitáceas provoca una reducción de la productividad del cultivo y además, los frutos pueden sufrir una maduración prematura, deformación y pérdida de sabor. El oídio de las cucurbitáceas puede ser causado por dos especies de ascomicetos, Golovinomyces cichoracearum o Podosphaera fusca, ambos ectoparásitos y biotrofos obligados que inducen síntomas idénticos pero que se pueden distinguir fácilmente al microscopio. En España, sin embargo, disponibles indican que el oídio de las cucurbitáceas parece estar causado únicamente por P. fusca. A pesar de que se disponen de algunas variedades resistentes de cucurbitáceas, en la práctica, el control químico es el tipo de control más empleado en la lucha contra el oídio. El control químico, no obstante, presenta el grave inconveniente de la aparición de resistencias, especialmente contra aquellos productos que presentan unas dianas de actuación muy específicas, y en este sentido, los oídios destacan por su gran capacidad para el desarrollo de resistencia a estos compuestos.
Como el control de los oídios es, hoy por hoy, absolutamente dependiente del control químico, ante el repetido fracaso de las medidas de control convencionales en algunas de las zonas dedicadas al cultivo de cucurbitáceas en nuestro país, se hacía necesario conocer el estado de los niveles y frecuencias de resistencia a los fungicidas antioídio más utilizados en las poblaciones de P. fusca, con vistas al desarrollo de programas de control de la enfermedad más eficaces. Para ello, procedimos a la generación de una colección de aislados monoconidiales de oídio de cucurbitáceas procedentes de diferentes localizaciones, hospedadores y campañas de muestreo. Con estos aislados y con otras cepas de nuestra colección, se procedió a determinar, en primer lugar, los niveles de resistencia a estrobilurinas y fungicidas DMI en P. fusca, y en segundo lugar, evaluar las frecuencias de resistencia a estos fungicidas en las poblaciones de P. fusca del sur de España en los últimos tres años. El análisis de la sensibilidad/resistencia a fungicidas en P. fusca, se llevó a cabo utilizando una adaptación de método de disco de hoja, empleando discos de cotiledones de calabacín que se ponían en contacto con la concentración de fungicida a ensayar, para posteriormente ser inoculados con la cepa de P. fusca que se estaba analizando. Tras un período de incubación de 8 días, se procedía a evaluar el crecimiento y desarrollo del hongo sobre los discos. A partir de los resultados de crecimiento de una cepa determinada frente a diferentes concentraciones de un mismo fungicida, se procedía al cálculo de tres parámetros: concentración mínima inhibitoria (CMI), concentración efectiva 50 (CE50) y factor de resistencia (FR). De este modo, se ensayaron cincuenta cepas de P. fusca frente a tres estrobilurinas (QoIs): azoxistrobin, kresoxim-metil y trifloxistrobin; y tres inhibidores de demetilación (DMI): fenarimol, miclobutanil y triadimenol.
Con respecto a las estrobilurinas, cabe destacar dos hechos fundamentales.
En primer lugar, que se observó una resistencia de tipo cualitativo; aparecieron cepas sensibles y muy resistentes, con clara diferencia entre ellas, lo que se traducía en factores de resistencia muy elevados. El otro hecho destacable es que la resistencia fue siempre cruzada, de modo que toda cepa que era resistente a una de las estrobilurinas lo era también a las otras dos. En relación a los DMI, los resultados obtenidos fueron más heterogéneos que los obtenidos para las estrobilurinas.
Así, frente al miclobutanil, la respuesta obtenida indicaba que la mayoría de las cepas eran sensibles al fungicida y sólo un pequeño número de cepas presentaba cierta tolerancia al fungicida. Frente al triadimenol, se obtuvo un perfil de resistencia similar, pero a pesar de que la mayoría de las cepas podían ser consideradas como sensibles, un pequeño número de cepas mostraron una tolerancia más acentuada, por lo que en este caso sí parecía oportuno catalogar a estas cepas como resistentes, siendo el tipo de resistencia observado de tipo cualitativo, aunque para confirmar este punto sería necesario analizar un mayor número de cepas resistentes. Por último, el análisis de sensibilidad/resistencia a fenarimol reveló un comportamiento diferente a los anteriormente descritos; frente a un conjunto de cepas sensibles al fungicida se observaba otro conjunto de cepas que presentaban niveles variables de tolerancia. De esta manera, el perfil de resistencia observado para fenarimol, a diferencia de los anteriores, resultó ser de tipo cuantitativo. En base a resultados se establecieron concentraciones de fungicida que permitieran diferenciar entre aislados de P. fusca sensibles y resistentes a las estrobilurinas y a los fungicidas DMI ensayados, que posteriormente serían utilizadas para determinar frecuencias de resistencia a estos fungicidas en las poblaciones de oídio de cucurbitáceas.
Una vez establecidas las concentraciones de QoI y DMI que permitían la identificación de aislados resistentes, procedimos a evaluar la distribución de la resistencia a estos fungicidas en las poblaciones de P. fusca del sur de España.
Para ello se analizaron 250 cepas aisladas de Almería, Badajoz, Ciudad Real, Córdoba, Murcia y Valencia, obtenidas de diferentes cultivos de cucurbitáceas a lo largo de las campañas 2002, 2003 y 2004. Los resultados obtenidos demuestran que las frecuencias de resistencias varían mucho en función de la zona de cultivo analizada. Así, con respecto a la resistencia a QoIs, no se detectó resistencia en las cepas obtenidas en Badajoz y en Almería y Valencia las frecuencias de resistencia observadas fueron relativamente bajas. Por el contrario, en Córdoba, Ciudad Real y Murcia las frecuencias de resistencia a estrobilurinas fueron muy elevadas. Alrededor de la tercera parte de las cepas analizadas mostraron resistencia y la mayoría de éstas procedían de cultivos de melón. Con respecto a los fungicidas DMI, no se ha observado resistencia a miclobutanil en ninguna de las zonas ni de los cultivos estudiados. Frente a triadimenol, sólo se encontró resistencia en Almería y Murcia y la mayoría de las cepas resistentes fueron aisladas de calabacín. En lo que concierne a fenarimol, se detectaron más cepas resistentes especialmente en Badajoz, Murcia y sobre todo Almería, y como en el caso del triadimenol, también es en calabacín donde se aíslan la mayor parte de las cepas resistentes. Además, se han encontrado algunas cepas con resistencia cruzada a triadimenol y fenarimol, pero en ningún caso se encontraron cepas resistentes a QoIs y a triadimenol o fenarimol.
Este análisis de distribución de frecuencias de resistencia a QoIs y DMI en el sur de España, permite hacer una serie de recomendaciones con respecto al uso de estos fungicidas en el control del oídio de las cucurbitáceas que se resumen en la Figura 3. Como se aprecia en el mapa, el uso de estrobilurinas (QoIs) no es aconsejable, al menos temporalmente, en las provincias de Córdoba, Ciudad Real y Murcia, mientras que en Almería y Valencia deben usarse con precaución.
Con respecto a los fungicidas DMI, su uso en la provincia de Almería no es aconsejable por el momento, mientras que en Badajoz y Murcia deben emplearse con restricciones.
Consideraciones finales
La resistencia a fungicidas, tanto a inhibidores de la biosíntesis del ergosterol, como a estrobilurinas, es un hecho en nuestros cultivos de cucurbitáceas. Como la resistencia a estos fungicidas en las poblaciones de oídio del sur de España es muy variada, no nos valen recomendaciones generales, sino que deben ir encaminadas a cada una de las zonas productoras, puesto que las diferencias en las frecuencias de resistencia observadas son notables. El desarrollo de resistencia a un fungicida es resultado de la presión de selección que se ejerce sobre las poblaciones del patógeno mediante el uso continuado de dicho fungicida u otros con idéntico mecanismo de acción. Por tanto, para evitar el desarrollo de resistencias o disminuir sus frecuencias es imprescindible rebajar la presión de selección.
En el mercado existe un gran número de fungicidas antioídio con diferentes mecanismos de acción, y siempre que se realicen mezclas o alternancias de materias activas, no basta con que sean productos diferentes o que pertenezcan a familias químicas diferentes, sino que tengan diferente mecanismo de actuación, se puede conseguir un control adecuado de la enfermedad.
El análisis de la distribución de frecuencias de resistencias a QoI y DMI en oídio de cucurbitáceas que hemos realizado, ha revelado que en determinadas zonas del sur de España, los programas de control de la enfermedad hacen un uso muy limitado de la variedad de materias activas con diferentes mecanismos de actuación disponibles. Por lo tanto, es necesario diversificar y ampliar el espectro de productos que actualmente se usan y dejar de usar, al menos temporalmente, algunos de ellos. Sólo así se podrá llevar a cabo un control eficaz de la enfermedad y eludir en lo posible los problemas derivados del desarrollo de resistencias. En algunos países se recomienda el empleo de fungicidas de amplio espectro y acción multisitio, para alternar o mezclar con antioídios específicos.
Si bien es verdad que los primeros no son sistémicos, por lo que no alcanzan bien a todas las partes de la planta y no tienen especial eficacia frente a este tipo de patógenos, el hecho de que frente a ellos no se haya descrito resistencia hace que puedan eliminar una buena parte de las poblaciones resistentes a otros fungicidas específicos, lo que es muy interesante. En cualquier caso, siempre deben alternarse o mezclarse al menos dos fungicidas con diferente mecanismo de acción, de hecho se pueden encontrar en el mercado algunas de estas mezclas autorizadas para su uso bien en cucurbitáceas en general, bien para un cultivo determinado.
Para concluir, es necesario considerar aquí posibles alternativas al control químico que puedan aliviar la presión de selección que supone el empleo de fungicidas como única herramienta de control de los oídios y contribuir al manejo de las resistencias. En este sentido, aparecen en la literatura científica como alternativas o como medidas complementarias al control químico, el empleo de carbonatos, silicatos, aceites, detergentes, extractos vegetales y agentes de control biológico como hongos micoparásitos y levaduras y bacterias antagonistas; si bien es cierto que de forma individualizada los resultados ofrecidos por tales medidas no son comparables a los resultados que hoy por hoy ofrece el control químico. No obstante, ante el creciente problema de desarrollo de resistencias a los fungicidas habituales en las poblaciones de oídio de cucurbitáceas en nuestro país, es razonable pensar que en un futuro cercano estas prácticas alternativas deberán formar parte de los programas de control integrado de la enfermedad. Entretanto, la posibilidad de disponer de sistemas rápidos de diagnóstico de la resistencia a QoI y DMI en oídio de cucurbitáceas sería una herramienta de extraordinaria de utilidad para el manejo de estas resistencias.
