Sección: 16º symposium internacional sobre la problemática actual de las resistencias en cultivos mediterráneos
Abstract: La secuenciación de genomas, los cribados sistemáticos de colecciones de genes y las técnicas de expresión heteróloga han permitido avances importantes en varias áreas de la biología. Sin embargo son pocos los ejemplos en los que estas técnicas hayan sido aplicadas para remediar plagas agronómicas. En este estudio se propone el empleo de una tecnología denominada "phage display" para el cribado funcional y sistemático de genes con un posible papel en el reconocimiento planta-patógeno y la generación de resistencias. El cribado ha conducido a la identificación de una proteína vegetal capaz de reconocer Pseudomonas sp.
La resistencia a pesticidas es un problema en aumento en los cultivos modernos. Sin embargo, y a pesar de que se han realizado muchos esfuerzos para investigar el modo de acción de los pesticidas, las bases moleculares de la resistencia permanecen en gran parte desconocidas.
Es más, nuestro conocimiento de los mecanismos involucrados en las interacciones planta-patógeno y la respuesta defensiva de las plantas es muy escaso, y hoy día muchos pesticidas son empleados en el campo sin ningún conocimiento previo de sus dianas moleculares. Las estrategias "genome-wide" pueden conducirnos a un mejor entendimiento de los mecanismos a través de los que plantas y patógenos interactúan y aumentar las posibilidades de controlar las resistencias cuando estas aparecen.
En este estudio empleamos la estrategia de "phage display" para llevar a cabo un cribado a gran escala que permitiera poner de manifiesto proteínas vegetales capaces de reconocer microorganismos patógenos. La estrategia consiste en la clonación de un repertorio de genes, representando las proteínas de interés en el genoma vegetal, como productos de fusión a la proteína de la cápsida de un virus bacteriófago. El repertorio de fagos recombinantes se enfrenta al patógeno ("biopanning") y aquellos capaces de reconocer y unirse a éste se recuperan junto al gen codificante, en el interior de la cápsida. El poder de la tecnología del "phage display" radica en que conecta de manera funcional fenotipo y genotipo recombinante, permitiendo el cribado rápido de un gran número de clones diferentes y el co-aislamiento simultaneo de una proteína junto a su secuencia codificante.
Resultados
Se construyó una genoteca a partir de cDNA provinente de material vegetal (bulbos de Allium sativum) enfrentado a una mezcla de microorganismos patógenos durante media hora. Los genes expresados en esta situación se clonaron dentro del genoma del fago T7, en fase con la proteína 10-3b -uno de los componentes de la cápsida del fago- y en una disposición que permite que la proteína quede expuesta al exterior y permanezca funcional y accesible a los microorganismos (Figura 1).
El repertorio de fagos recombinantes conseguido en la genoteca representaba unos 104 insertos de cDNA provinentes de distintos genes expresados por la planta tras la infección. Se incubó con distintos patógenos en varias condiciones y los fagos capaces de pegarse al patógeno entero y vivo se separaron del resto por centrifugación del patógeno y posterior elución. Los fagos así eluídos se amplificaron e incubaron de nuevo con el patógeno hasta en 3 rondas de biopanning, de manera que los amplificados se fueron enriqueciendo sucesivamente en los clones de interés.
El cribado permitió la identificación de 4 proteínas diferentes codificadas en el genoma de A. sativum capaces de reconocer especies patogénicas. El clon AS3-1-P codifica para un fragmento C-terminal de 22 aminoácidos sin homología conocida. AS3-1-P se une a las membranas de Pseudomonas sp. con una afinidad varias veces superior al control, aunque no se detectó actividad antibacteriana de la proteína en un antibiograma a las concentraciones ensayadas (Figura 2).
Discusión
Este estudio ha permitido testar hasta 104 clones diferentes, representando genes que se expresan tras la exposición de la planta a microorganismos, por su capacidad para reconocer y unirse a distintos patógenos. También permite ensayar la actividad antibacteriana o antifúngica de dichas proteínas vegetales, abriendo una vía para el descubrimiento de posibles bio-pesticidas producidos naturalmente por las plantas como defensa ante las infecciones microbianas.
Una estrategia similar a partir del DNA expresado por el patógeno en presencia de la planta permitiría, recíprocamente, identificar proteínas activas en el reconocimiento de la planta por el patógeno. La tecnología del "phage display" se ofrece como una herramienta valiosa para la exploración funcional del genoma de plantas y microorganismos y para la identificación de mecanismos que podrían constituir las bases moleculares de las resistencias.
