16º symposium internacional sobre la problemática actual de las resistencias en cultivos mediterráneos
La resistencia y sus mecanismos
Se considera resistencia como la capacidad de un patógeno para sobrevivir a niveles letales de un fungicida o bactericida. Sin embargo, hay que distinguir la resistencia innata, que es inherente a un patógeno que nunca fue sensible, de la resistencia adquirida que es la capacidad de un patógeno para sobrevivir a niveles de fungicida o bactericida que previamente le resultaron letales.
Los mecanismos de la resistencia son muy diversos y pueden ser ocasionados por una disminución de la permeabilidad celular al producto, destoxificación bien sea por modificación química o por inmovilización, o por una disminución de la afinidad de dicho producto por la diana celular. Tambien puede ocurrir que el cambio en el patógeno comporte la superación mediante una nueva ruta metabólica de la etapa bloqueada, o que se compense el efecto inhibitorio mediante una mayor producción de la diana celular inhibida.
Sin embargo, los productos no inducen resistencia sino que seleccionan una población del patógeno que ha mutado o adquirido dicha capacidad mendiante intercambio genético. Además aunque la resistencia pueda demostrarse a menudo en el laboratorio mediante el estudio de aislados del patópgeno, esto no significa que la eficacia en campo se vea inmediatamente afectada.
Análisis de la resistencia y patrones de evolución
Para detectar la aparición de resistencias a un producto se realizan prospecciones de poblaciones del patógeno y se determinan in vitro los niveles de sensibilidad con el fin de establecer la linea de base en un momento dado. Estos niveles se determinan bien mediante el análisis de la concentración mínima inhibitoria (CMI) o tras el estudio de la relación entre su concentración y el nivel de inhibición, también denominadas curvas dosis-respuesta. Aunque la CMI y las curvas dosis-respuesta en ensayos in vitro son los métodos más utilizados, tambien se utilizan otros métodos como ensayos ex vivo, in planta o de campo, o mediante la detección directa por PCR de genes marcadores asociados a la resistencia.
El análisis de la CMI se realiza incorporando en un medio de cultivo agarificado el producto objeto del estudio a distintas concentraciones decrecientes (generalmente a la mitad), partiendo de una concentración a la que se inhiba totalmente el crecimiento (Figura 1). La CMI corresponde a aquella concentración más baja que inhibe completamente la formación de colonias del patógeno.
Este método es relativamente rápido pero aporta menos información que el análisis dosi-respuesta. En este caso se cuantifica la proporción de inhibición del crecimiento respecto a un control sin producto, ya sea en medio de cultivo sólido o líquido, mediante análisis de probits, igual que se realiza en toxicología, de modo que se determina la concentración efectiva mediana (DE50) y la eficacia relativa (pendiente)(Figura 2). Estos valores se determinan para una población estadísticamente significativa de cepas aisladas, lo que permite estimar la media y su desviación y comparar poblaciones de diferentes localidades, cultivos, etc. (Figura 3).
A lo largo de la considerable experiencia acumulada en el seguimiento de la aparición de resistencia a diversos fungicidas y bactericidas se ha observado que los patrones de evolución en el tiempo obedecen a dos tipos (Figura 4). Un patrón discreto en el que el paso de una población del patógeno tolerante a resistente se produce de forma brusca, y un patrón denominado de pasos múltiples o progresivo, en el que la población se va enriqueciendo en individuos con niveles de resistencia cada vez más elevados.
Casos concretos y riesgo intrínseco al producto
La resistencia a bactericidas en bacterias fitopatógenas, aunque puede ser causada por cualquiera de los mecanismos descritos al principio, es más preocupante cuando está codificada genéticamente por elementos extracromosómicos como los plásmidos. La experiencia es amplia y las referencias más bien estudiadas datan de finales de los ochenta principios de los 90 (Tabla 1). Diversas cepas de bacterias fitopatógenas como Xanthomonas axonopodis pv. Vesicatoria en tomate y pimiento, Pseudomonas syringae (diversos patovares) en tomate, frutales de hueso y de pepita, y Erwinia amylovora en peral y manzano han sido descritas como resistentes a cobre y a antibióticos del grupo de los aminoglicósidos (estreptomicina). En el caso de los antibióticos dicha resistencia limitó significativamente la eficacia en el control de la bacteriosis.
La resistencia a fungicidas está mucho más documentada, por la gran diversidad de hongos fitopatógenos y enfermedades que causan, así como por la cantidad de materias activas fungicidas de que disponemos. En muchos casos existe un dato muy útil en epidemiología de la resistencia, que es el tiempo transcurrido entre la comercialización de una materia activa y la detección de resistencia en un patógeno diana. Aunque dicho tiempo depende no sólo de la materia activa, sino tambien del patógeno y del huésped, se observa que en fungicidas como los inhibidores del coenzima Q (QoIs), principalmente compuestos por estrobilurinas, dicho periodo es de 2-4 años, o como en el caso de las polioxinas que es de 4-5 años. En los otros fungicidas tales como los bencimidazoles, dicarboximidas, inhibidores de la biosíntesis de esteroles y fenilamidas dicho período es muy variable entre 2 y 20 años dependiendo del patosistema y materia activa. En las morfolinas y en los fungicidas de diana múltiple como los ditiocarbamatos se ha observado tras 30-40 años o no se ha detectado (Tabla 2).
En cuanto al riesgo intrínseco al producto, existen diversas clasificaciones tanto del Fungicide Resistance Action Commitee (FRAC) como de diversos autores.
Dichas clasificaciones se centran sobre todo en el riesgo como consecuencia del mecanismo de acción. Así, cuando el mecanismo de acción es puntual, la probabilidad es superior a cuando el mecanismo es múltiple. (Tabla 3 y 4).
A los fungicidas cuyo mecanismo de acción es múltiple como ditiocarbamatos, ftalimidas, sulfamidas, cobres, guanidinas, y cloronitrilos se les atribuye un riesgo bajo. Con riesgo medio se clasifican los fenilpirroles (inhibidores de MAPproteinquinasa), carboxamidas (inhibidores de la biosíntesis de melanina), anilino-pirimidinas (inhibidores de la síntesis de metionina), pero tambien algunas materias activas correspondientes a inhibidores de ensamblaje de tubulina (benzamidas), e inhibidores de la biosíntesis de esteroles (clases II y III). Con riesgo elevado se consideran los inhibidores de la respiración celular (estrobilurinas y cianoimidazoles), algunos inhibidores de la biosíntesis de esteroles (inhibidores de demetilación, clase I), dicarboximidas, algunos inhibidores de ensamblaje de tubulina (N-fenilcarbamatos y benzimidazol carbamatos) y antibióticos aminoglicósidos.
Riesgo ligado al potencial evolutivo del patógeno
McDonald y Linde han propuesto que el potencial evolutivo del patógeno está relacionado con su capacidad para superar barreras como la resistencia del huésped y que éste puede relacionarse con la probabilidad de aparición de resistencia a fungicidas. El potencial evolutivo del patógeno depende del grado de variabilidad genética de éste, ocasionada tanto por procesos de mutación (cambio génico) como de intercambio genético (reproducción sexual o parasexual), y de la intensidad del flujo genético, principalmente dependiente de los mecanismos de dispersión del patógeno (aire, suelo, agua, material vegetal, etc.)(FIGURA 5). Obviamente, el factor motriz de la resistencia, una vez se genera una fracción de la población resistente, es la selección y enriquecimiento de dicha población por la presencia del fungicida-bactericida. Tanto en bacterias fitopatógenas como en hongos los procesos de mutación ocurren de forma espontánea con una probabilidad media de 10-9 mutantes por generación.
Sin embargo la fuente de variabilidad más importante es la reproducción sexual que comporta una hibridación entre la dotación genética de cada progenitor. En el caso de las bacterias, como típicos procariotes, su reproducción es asexual y por tanto comporta poca variabilidad genética, aunque existen procesos de intercambio genético como la conjugación que son responsables de una de las manifestaciones de la transferencia de la resistencia más espectacular, como en los antibióticos de uso clínico y veterinario. En cambio, en los hongos fitopatógenos, excepto en aquellos en que en su ciclo biológico domina la fase asexual (deuteromicetes), la reproducción sexual comporta una fuerte variabilidad genética (ficomicetes, ascomicetes, basidiomicetes) y gran capacidad de adaptación a cambios en el entorno. Así, Mc-Donald y Linde han propuesto como factores que determinan el potencial evolutivo la frecuencia de mutación (incrementada por la presencia de elementos transponibles), el tamaño poblacional (propágulos invernantes, extinción local, deriva), la transferencia génica (dispersión aérea, material vegetal-hombre) y el sistema reproductivo (asexual, sexual) (Tabla 5). Así por ejemplo, patógenos de alto riesgo por su elevado potencial evolutivo serían Puccinia o Venturia, mientras que se consideran de bajo riesgo Penicillium o Colletotrichum, debido a su potencial evolutivo menor.
Riesgo combinado y estrategias antiresistencia
En base al riesgo intrínseco atribuído principalmente al mecanismo de acción del producto y al riesgo ligado al potencial evolutivo del patógeno, se puede establecer un riesgo combinado que tenga en cuenta ambos factores de riesgo (Figura 6). Fungicidas como bencimidazolcarbamatos, dicarboximidas, inhibidores de biosíntesis de esteroles (Clase I) y QoIs aplicados para el control de patógenos como Blumeria, Puccinia, Bremia y Phytophthora suponen el máximo riesgo de selección de resistencia. Por el contrario, productos como las carboxamidas, fenilpirroles, ditiocarbamatos, guanididnas, cloronitrilos, cobres para el control de hongos como Fusarium, colletotrichum o Cladosporium, o de bacterias (cobres) suponen un riesgo mínimo de resistencia.
Sin embargo, otros factores de riesgo de tipo agronómico, además de los descritos inherentes al patógeno o al mecanismo de acción de la materia activa, influyen en la presión de selección de cepas resistentes, como las características del cultivo, la zona geográfica donde se aplica el producto y el modo de empleo.
La introducción de variedades del cultivo muy sensibles a una determinada enfermedad en zonas donde ésta es endémica, la no adopción de medidas profilácticas tendentes a disminuir la emisión de inóculo del patógeno, el excesivo vigor de las plantas, confiar la protección exclusivamente en materias activas con el mismo mecanismo de acción o intervalos entre aplicaciones demasiado largos, son ejemplos de malas prácticas agronómicas que incrementan la presión de selección de cepas resistentes.
De acuerdo con lo expuesto se aplican estrategias antiresistencia que permiten disminuir el riesgo hasta niveles aceptables. En términos generales éstas consisten en evitar dosis subletales siguiendo las recomendaciones del producto y limitar aplicaciones repetidas de productos con el mismo mecanismo de acción, y alternar (o combinar) productos con distinto mecanismo de acción o con mecanismo múltiple (de contacto). Estas estrategias deben complementarse con otras medidas como la elección del momento de tratamiento mediante sistemas de avisos de riesgo de infección (Estaciones de Avisos Fitosanitarios), cultivares resistentes, eliminación de restos vegetales infectados y otros métodos que permitan disminuir el potencial de inóculo del patógeno.
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