Sección: 16º symposium internacional sobre la problemática actual de las resistencias en cultivos mediterráneos
Abstract: Entre las malas hierbas más importantes que merman la producción del cultivo del arroz en el mundo destaca el género Echinochloa. Debido a la especificidad de este cultivo, el número de herbicidas disponibles para controlar esta gramínea no es tan amplio como en otros cultivos ocasionando la rápida aparición de resistencia múltiple a herbicidas con modos de acción diferentes. Entre los mecanismos más importantes estudiados hasta el momento en los biotipos resistentes de Echinochloa spp. destacan, la absorción diferencial debido a la presencia de las ceras epicuticulares, primera barrera selectiva al paso de herbicidas, translocación diferencial del herbicida, metabolismo acelerado llevado a cabo por los sistemas enzimáticos citocromo P450 y glutatión-S-transferasas y sobreexpresión de las enzimas diana, principalmente la acetolactato sintasa (ALS) y la acetil coenzima A carboxilasa (ACCasa). Todavía no ha sido reportado ningún biotipo de Echinochloa spp. resistente por alguna mutación puntual en el gen que codifica. Entre los métodos de control más apropiados destacan la rotación de cultivos en las zonas donde sea posible y las mezclas sinérgicas de herbicidas con modos de acción distintos disminuyendo la dosis de aplicación cuando sea posible.
El género Echinochloa
El género Echinochloa P. Beauv. pertenece a la tribu de las Paniceas R. Br., subfamilia de las Panicoideas A. Br., familia de las Gramíneas Juss. Habitan en zonas húmedas, producen graves daños en las cosechas y afectan considerablemente a su rendimiento. Su emergencia es escalonada, precisando de tratamientos repetidos para su control (FUENTES, 1991). Altas infestaciones de esta gramínea pueden llegar a reducir la cosecha en más del 80%. Este género se encuentra ampliamente representado en todas las regiones cálidas y templadas del mundo. No hay acuerdo en el número de especies que integran Echinochloa, se citan entre veinte y cincuenta especies (CORRELL y CORRELL, 1975; MICHAEL, 1983; LÓPEZ-MARTÍNEZ y col., 1999). Debido a la difícil taxonomía de este género, existe una gran confusión que en la actualidad dificulta extraordinariamente la interpretación de las investigaciones realizadas sobre la biología de esta importante gramínea.
En los arrozales españoles se han citado entre tres y cinco taxones de Echinochloa (CLAYTON, 1980; CARRETERO, 1981). Tres de estos taxones, E. hispidula (Retz.) Nees ex Royle (E. crus-galli subsp. hispidula (Retz.) Honda), E. oryzoides (Ard.) Fritsch y E. oryzicola (Vasing.) Vasing. in Komarov son específicos del cultivo del arroz, y los otros dos, E. crus-galli (L.) Beauv. subsp. crus-galli y E. colona (L.) Link pueden encontrarse además en otros cultivos estivales de regadío. E. colona no suele invadir el interior de los campos de arroz, sino que permanece más bien en los márgenes o en las proximidades de los mismos. En Europa occidental se ha registrado en los arrozales de Sicilia y en España, en campos de arroz donde el nivel del agua es bajo como Calasparra (Murcia). E. colona es claramente distinguible por el tamaño de su espiguilla, que es la más pequeña del género. La distinción entre el resto de las especies está basada en características de la inflorescencia, de las espiguillas, de las cariópsides y de las hojas, aunque muchos de estos caracteres, individualmente considerados, no permiten una separación neta de los taxones por la existencia de solapamiento.
Cuando se usan claves morfológicas, el mayor problema respecto a la clasificación botánica surge entre E. oryzoides y E. crus-galli subsp. hispidula, debido a que adoptan caracteres inestables, y además, la segunda es altamente polimórfica (GONZÁLES-ANDRÉS y col., 1996; CARRETERO, 1981). Tradicionalmente, los métodos para separar taxones, así como para estimar las relaciones filogenéticas existentes entre ellos se han basado en el estudio de caracteres morfológicos.
Sin embargo, estas características pueden ser alteradas por enfermedades, variar en función de la etapa del crecimiento o el ambiente agroclimático. Por eso, en la última década se han desarrollado técnicas de biología molecular que son útiles a la hora de identificar genotipos diferentes como son RAPDs (LÓPEZMARTÍNEZ y col., 1999; RUIZ-SANTAELLA y col., 2005b), microsatélites (DANQUAH y col., 2002) y AFLP (TSUJI y col., 2003), encontrándose en muchos casos ciertas discrepancias entre ambas técnicas, debiendo ser la experiencia del investigador la que valore la información que cada técnica puede aportar (Figura 1).
Biotipos resistentes
Desde la aparición del primer biotipo de E. crus-galli resistente a propanil en 1986 en Grecia (GIANNOPOLITIS y col., 1989), el número de biotipos resistentes se ha incrementado exponencialmente hasta la actualidad. Así, en el año 2000 en California estos biotipos presentaban resistencia múltiple a cihalofop-butilo, fenoxaprop-p-etilo, molinato y tiobencarbo (FISCHER y col., 2000a). Paralelamente se empezó a desarrollar resistencia a propanil en E. colona en Costa Rica en 1987 (GARRO y col., 1991) hasta la actualidad donde hay biotipos que presentan resistencia múltiple a azimsulfurón, fenoxaprop-p-etilo y propanil.
También han sido reportados en el año 1998 en arrozales de California la aparición de resistencia múltiple en biotipos de E. oryzicola a cihalofop-butilo, fenoxaprop-p-etilo, molinato y tiobencarbo y resistencia a fenoxaprop-p-etilo y molinato en biotipos de E. phyllopogon (FISCHER y col., 2000b). La situación en España no ha sido diferente a lo largo de la última década presentando en la actualidad resistencia a las auxinas sintéticas (quinclorac, LÓPEZ-MARTÍNEZ y col., 1998), propanil y atrazina (LÓPEZ-MARTÍNEZ y col., 1997). Con respecto a los graminicidas, en el caso de cihalofop-butilo aparecieron los primeros biotipos en arrozales de Badajoz los cuales de manera natural presentaban tolerancia.
También, y en base a los resultados obtenidos en campo, se sospecha la resistencia a profoxidim, molinato y azimsulfurón (CPRH, 2005) aunque todavía no han sido delucidados los mecanismos responsables.
Mecanismos de resistencia
El conocimiento de los procesos biológicos responsables de la resistencia a herbicidas en una determinada mala hierba es fundamental para el diseño de una estrategia definitiva de control. Dependiendo del tipo de mecanismo de resistencia detectado, la mala hierba presentará un patrón específico en su resistencia/tolerancia a herbicidas que podrá variar desde un alto grado de resistencia a determinados compuestos de una misma familia química, a una moderada resistencia a un amplio espectro de herbicidas. Asimismo el conocimiento de estos mecanismos nos permitirá prever la posible respuesta de la población resistente al conjunto de mecanismos químicos/mecánicos/culturales seleccionados para su control, la efectividad a corto y largo plazo de los mismos y la posible aparición de nuevos problemas. Existen al menos tres mecanismos generales, no necesariamente excluyentes que podrían justificar la resistencia a herbicidas (Figura 2):
a) Reducción de la concentración de herbicida en el sitio de acción
Una condición necesaria para lograr la efectividad de un herbicida es que éste alcance su sitio de acción en una concentración suficiente como para que su efecto sea letal. La falta de movimiento de un herbicida posibilitará reducir la concentración de éste en el sitio de acción, lo que permitirá al último mantenerse funcional. Estas bajas concentraciones pueden lograrse ya sea mediante una reducción en la penetración, absorción o translocación o por la existencia de fenómenos de secuestración en orgánulos celulares más o menos translocables.
La falta de absorción/penetración/translocación de herbicidas es básicamente un mecanismo de tolerancia existente en numerosos cultivos y algunas malas hierbas (DE PRADO y col., 2005; MICHITTE y col., 2004). En el caso de E. phyllopogon y E. oryzoides se han encontrado diferencias entre biotipos resistentes y sensibles en cuanto a la densidad, distribución y forma de las ceras epicuticulares presentes en la cutícula constituyendo la primera barrera selectiva a la que debe enfrentarse un herbicida (RUIZ-SANTAELLA y col., 2005a). Aún cuando pueden estudiarse por separado, estos mecanismos resultan difíciles de diferenciar entre sí, dado que una absorción diferencial suele implicar una translocación diferencial, y una translocación diferencial puede derivar de la diferente degradación del herbicida en el sitio de absorción, la cual resulta en metabolitos más o menos translocables.
b) Metabolización a especies no tóxicas
Constituye el mecanismo de resistencia más importante encontrado hasta el momento en las especies del género Echinochloa. Teóricamente cualquier herbicida, independientemente de la familia química a la que pertenezca o de su modo de acción puede ser metabolizado mediante reacciones de oxidación mediadas por el sistema enzimático citocromo P450 (CYP P450) o ser conjugado por medio de la GST (glutatión-S-transferasa) formando en ambos casos metabolitos no tóxicos o con una toxicidad inferior a la del herbicida original. Numerosos trabajos han sido reportados en los que estos sistemas están implicados. Así, en E. phyllopogon la resistencia a bensulfurón-metilo y bispiribac-Na [ambos inhibidores de la acetolactato sintasa (ALS)] era debida a un metabolismo diferencial mediado por CYP P450 (OSUNA y col., 2002). En el caso de cihalofop-butilo han sido reportados recientemente los mecanismos de tolerancia en arroz, los cuales se basan principalmente en una inactivación de las esterasas y en un metabolismo acelerado de la forma ácida del herbicida, y en el que están implicados tanto CYP P450 como GST (RUIZ-SANTAELLA y col., 2005a). También pueden estar implicados otros sistemas enzimáticos, como la acilarilamidasa responsable del metabolismo de propanil donde en los biotipos resistentes de E. colona se produce de una manera más rápida que en aquellos sensibles (LEAH y col., 1995).
c) Mutación en el sitio de acción diana (target site)
Actualmente constituye uno de los mecanismos más importantes, causando resistencia a una o varias familias químicas herbicidas con el mismo modo de acción.
Se han descrito mutaciones en la ACCasa plastídica de la mayoría de las gramineas (i.e. Lolium spp., Alopecurus myosuoides) en la región A (posición aminoacídica 1781) y en la región B (2027, 2041, 2078 y 2096). En Echinochloa spp. todavía no han sido descritas mutaciones a nivel de la ACCasa, siendo los anteriores mecanismos descritos los que causan resistencia. Sin embargo, se han descrito mecanismos de resistencia a atrazina en biotipos de E. crus-galli debido a una mutación puntual en la proteína tilacoidal D1 (aceptor quinónico secundario en el sitio reducido Qb del PSII) la cúal es codificada por el gen psbA del cloroplasto (LÓPEZ-MARTÍNEZ y col., 1997) . Aunque estos son los mecanismos de resistencia más importantes, existen otros dependiendo del modo de acción del herbicida empleado. Así, en el caso de quinclorac (auxina sintética) en el biotipo sensible de Echinochloa spp. se encontró que la causa era un incremento de la producción de etileno y formación de HCN como coproducto tóxico (LÓPEZ-MARTÍNEZ y col., 1998).
Control químico
El control eficaz de las diferentes especies de Echinochloa sigue siendo el principal objetivo y también la asignatura pendiente para la mayoría de los arroceros.
Lo primero que se debe conocer es qué especies de Echinochloa están presentes en los arrozales aunque la distinción entre las diferentes especies en fases iniciales (1-4 hojas) es prácticamente imposible. Normalmente pueden encontrarse hasta 2 especies diferentes de Echinochloa (E. crus-galli [subsp. crusgalli e hispidula] y E. oryzoides) y no todas ellas germinan al mismo tiempo ni poseen la misma sensibilidad a los herbicidas actualmente autorizados. Para el control de Echinochloa spp. el arrocero dispone de tres tratamientos básicos, cada uno de ellos con sus ventajas e inconvenientes y que puede adaptar a las características particulares de la zona, de la variedad de arroz cultivada, del manejo de agua y del tipo de especies de Echinochloa dominantes (MÁRQUEZ, 2002), entre otros factores (Tabla 1).
En los tratamientos de presiembra y post emergencia precoz, se emplean normalmente herbicidas tiocarbamatos (inhibidores de la síntesis de lípidos en un punto distinto de la enzima ACCasa), siendo el molinato la materia activa más utilizada. Esta modalidad de tratamientos no ha estado nunca muy extendida y se ha limitado a zonas que, históricamente, no poseían un buen control del agua, como Valencia. La corta persistencia de los herbicidas utilizados en estas fases condiciona notablemente la eficacia final contra las especies de Echinochloa (MÁRQUEZ, 2002). Dos variantes de los tratamientos en pre-siembra estarían constituidas respectivamente por las aplicaciones de anti-gramíneos específicos contra O. sativa L. (arroz salvaje) mediante el uso de glifosato y cicloxidim y los tratamientos de oxadiazón contra Heteranthera spp. (ZARAGOZA y col., 1993). Ambos tipos de aplicación tienen efectos contra Echinochloa spp., que en condiciones normales será siempre parcial ya que se producirán nuevas germinaciones durante el desarrollo del cultivo.
La segunda alternativa son los tratamientos de postemergencia precoz a base de granulados y al igual que en el caso anterior, se utilizan básicamente tiocarbamatos o combinaciones entre ellos (molinato, dimepiperato, tiobencarbo, molinato y bensulfurón-metilo, molinato y tiobencarbo, molinato y mefenacet, molinato y dimepiperato). Todos estos productos son activos fundamentalmente contra Echinochloa spp. Estos herbicidas se aplican en post-emergencia precoz, 1-(2)-3 semanas después de la siembra según zonas y condiciones climáticas, sobre Echinochloa spp. (1-3 hojas). El interés de este tipo de tratamientos radica en que consiguen controlar la primera emergencia o generación de Echinochloa spp. pero debido a la persistencia limitada de los tiocarbamatos, se suelen producir reinfestaciones (MÁRQUEZ, 2002). Estas nuevas nascencias necesitan ser controladas con tratamientos adicionales en postemergencia media-tardía. Los últimos se integran en tratamientos de postemergencia foliar, dependiendo del perfil y de la flexibilidad que ofrecen los productos actualmente disponibles (estado de desarrollo de Echinochloa spp.), la postemergencia puede ser, precoz [1-2 (-3) hojas en el caso de cihalofop- butilo], media (4 hojas-inicio de ahijado en el caso de azimsulfurón, con un espectro de control que incluye no sólo Echinochloa spp. sino también ciperáceas y otras malas hierbas de hoja ancha) o tardía (ahijamiento en el caso de propanil, profoxidim y quinclorac). Prácticamente todos los herbicidas incluidos en este grupo son exclusivamente de acción foliar, a excepción de quinclorac y azimsulfurón, que están dotados asimismo de una cierta persistencia sobre nuevas germinaciones. Propanil sigue siendo utilizado en muchas ocasiones como tratamiento "apagafuegos", lo que implica que sea aplicado sobre plantas de Echinochloa spp. excesivamente desarrolladas, que ya han ejercido un nivel de competencia importante con el cultivo (MÁRQUEZ, 2002).
Se necesitan dosis elevadas, tratamientos secuenciales ("split") y el nivel de eficacia suele ser, en muchas ocasiones, incompleto (MÁRQUEZ, 2002). El quinclorac posee únicamente acción contra Echinochloa spp. siendo frecuente que se aplique en mezcla con propanil para completar el espectro de actividad sobre las diferentes especies de Echinochloa, ya que quinclorac solo, no controla E. crus-galli subsp. crus-galli y la eficacia contra E .crus-galli subsp. hispidula no es totalmente satisfactoria (LÓPEZ-MARTÍNEZ y col., 1997 y 1998).
Las mezclas con bensulfurón-metilo son bastante frecuentes, debido a su perfil de selectividad y a su buena compatibilidad en mezclas con otros herbicidas en tanque.
La problemática que ofrece el control de la flora orizícola típica, exige la puesta en práctica de programas o estrategias de tratamientos, selectivos y eficaces, que permitan aprovechar los efectos sinérgicos de las materias activas seleccionadas, en mezclas o en tratamientos secuenciales para poder asegurar, con el mínimo número de tratamientos por campaña, un buen control de las malas hierbas a lo largo del ciclo de cultivo y evitar la competencia en los periodos críticos. Actualmente, y desde hace algunos años se vienen utilizando las mezclas de herbicidas como medida eficaz de control de malas hierbas en el arroz. En las mezclas "one-shot", suelen aplicarse, en una sola aplicación, al menos dos o tres materias activas con modos de acción diferentes, consiguiendo un amplio espectro de control de malas hierbas. Hay que tener en cuenta los antagonismos que pueden derivarse de estas mezclas, puesto que muchas veces pueden derivarse problemas de pérdida de actividad de una materia activa cuando es aplicada en mezcla con otra, debido a que los surfactantes empleados pueden disminuir la actividad de las materias activas o la derivada de las propias materias activas, incluso producir efectos negativos como consecuencia del antagonismo.
Por eso, muchas veces, se formulan las aplicaciones "one-shot" como gránulos dispersables o solubles, donde en el producto sólido ya van incorporadas las materias activas. Estos tratamientos tienen la ventaja del ahorro que se produce sobre todo en la realización de labores agrícolas y de las propias aplicaciones, ya que al ser un cultivo acuático resultan bastante específicas y costosas. Sin embargo, la práctica más habitual son las mezclas de herbicidas en la propia cuba de aplicación, donde pueden mezclarse gran variedad de ingredientes activos en volúmenes que oscilan entre los 200 y 300 L. Las más utilizadas suelen ser aquellas que mezclan propanil (5.25 kg) con algún herbicida inhibidor de la ACCasa, principalmente los ácidos ariloxifenoxipropanoatos como profoxidim o cihalofop-butilo. A veces, es necesario reducir la dosis de alguno de los dos ingredientes activos para evitar la fitotoxicidad que puede darse en el cultivo. También la mezcla de cihalofop-butilo y profoxidim es posible reduciendo la dosis del último a la mitad (0.3 l). La mezcla de quinclorac y cihalofop-butilo ha mostrado un buen sinergismo cuando se reduce la dosis de quinclorac. Muchas especies resistentes a algún herbicida ven comprometida seriamente su supervivencia cuando las mezclas se aplican sobre ellas, demostrando su eficacia.
Agradecimientos: Los autores agradecen a la Consejería de Agricultura y Pesca (IFAPA, Proyecto CO3-187) la financiación de este trabajo.
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