La estructura de las variedades de mandarino cultivadas en España presenta importantes problemas (NAVARRO, 2005). En la primera parte de la campaña desde mediados de Septiembre a finales de Enero, existen diversas variedades de clementina de elevada calidad que permiten un abastecimiento continuo de los mercados internacionales en este periodo. Las clementinas tienen polen y óvulos viables, pero son sexualmente autoincompatibles, por lo que no se polinizan así mismas ni entre ellas y por tanto producen frutos sin semillas. Los mercados internacionales demandaban cantidades importantes de mandarinas tardías de calidad más allá del periodo de producción de las clementinas. Para cubrir esta demanda se introdujeron variedades de mandarinos híbridos como Fortuna, Nova, Ellendale u Ortanique. Estas variedades tienen polen y óvulos viables, pero como en el caso de las clementinas son autoincompatibles y producen frutos sin semillas Estas variedades tardías, además de problemas de calidad, tienen el gran inconveniente de que su polen puede fertilizar a las clementinas y a su vez ser fertilizadas por el polen de estas, lo que provoca la aparición de semillas en ambos grupos de variedades. Esto produce un importante problema comercial, ya que los consumidores no aceptan las mandarinas con semillas. Las medidas para disminuir la formación de semillas implican la separación de las colmenas de abejas de las parcelas de producción de híbridos, lo que provoca conflictos con el sector de la apicultura y no resuelve el problema. Además, recientemente han surgido problemas importantes debidos a los daños provocados por la Alternaria alternata en Fortune, que está provocando el arranque o sobreinjerto de esta variedad. Debido a esta situación el problema de la inadecuada estructura de variedades de los mandarinos sigue sin resolverse.
Obtención de híbridos triploides
La carencia de semillas es una condición básica que deben tener las variedades de cítricos destinadas al consumo en fresco en mercados de calidad.
Para ello las variedades deben ser autoincompatibles y además no presentar problemas de polinización cruzada con otras variedades. Esto es lo que sucede con las variedades de los grupos navel y satsumas, que son autoincompatibles, tienen polen inviable y presentan degeneración de los megasporocitos femeninos. Estos caracteres son extraordinariamente difíciles de incorporar a otras variedades, ya que entre otras razones se desconocen cuales son los mecanismos genéticos que los controlan.
En los cruzamientos sexuales convencionales, después de la meiosis tiene lugar la fecundación de un gameto femenino haploide por un gameto masculino haploide dando lugar a híbridos diploides con información genética de ambos parentales (Figura 1)
Una alternativa con gran potencial es la obtención de híbridos triploides, con 27 cromosomas (Figura 2) en vez de los 18 de las variedades normales diploides. Las plantas triploides son generalmente estériles y en consecuencia no producen semillas, ni siquiera por polinización cruzada. Esto es debido a que en la meiosis los gametos reciben distinto número de cromosomas, lo que causa esterilidad y en consecuencia no producen semillas o éstas abortan en su mayoría. Además, estas plantas no presentan problemas de polinización cruzada con otras variedades.
La obtención experimental de variedades triploides de cítricos se conoce desde la década de los años setenta del pasado siglo. Se pueden obtener mediante tres tipos de cruzamientos:
A) Cruzamientos entre parentales masculinos y femeninos diploides (2n x 2n). Encítricos se ha descrito hace tiempo que ocasionalmentese producen embriones triploides espontáneosdespués de la hibridación de dos parentalesdiploides. Ello es debido a que algunosgenotipos presentan anormalidades durante lameiosis y se producen algunos gametos femeninosno reducidos (diploides) que se fecundanpor gametos masculinos haploides dando lugara híbridos triploides que tienen doble informacióngenética del parental femenino (Figura 3).
La ventaja de esta aproximación es que puede utilizarse como parental masculino cualquier genotipo que tenga polen viable y sea compatible con el parental femenino.
B) Cruzamientos entre parentales masculinos tetraploides y femeninos diploides (2n x 4n). Es el método más clásico paraobtener híbridos triploides de cítricos. Losembriones de este tipo de híbridos se formanpor la fecundación de un gameto femenino haploidepor un gameto masculino que es diploideporque procede de la meiosis de célulastetraploides (Figura 4). La limitación de estemétodo es la escasa disponibilidad de parentalestetraploides de calidad, que se producende forma espontánea en algunas ocasionesen variedades poliembriónicas por autoduplicacióncromosómica de células de la nucela,que dan lugar a embriones y posteriormenteplantas nucelares tetraploides.
C) Cruzamientos entre parentales masculinos diploides y femeninos tetraploides (4n x 2n). Los híbridos triploides se originanpor la fecundación de un gameto femeninoreducido, que es diploide porque procedede la meiosis de células tetraploides, por ungameto masculino haploide (Figura 5). El procedimientotiene la ventaja teórica de poderusar un gran número de parentales masculinoscon elevada eficacia. El problema es queno existían mandarinos monoembriónicos parapoder usar este tipo de cruzamientos.
Hasta hace poco tiempo estas observaciones no tenían aplicaciones prácticas debido a tres grandes problemas para obtener poblaciones elevadas de híbridos triploides. Los embriones triploides se encuentran normalmente en semillas pequeñas parcialmente abortadas (Figura 6), que raramente germinan incluso en las mejores condiciones de invernadero.
El análisis del nivel de ploidía de plantas de cítricos por métodos histológicos clásicos (Figura 2) es extremadamente lento y poco eficaz, por lo que no puede aplicarse a grandes poblaciones.
Finalmente, existen muy pocos genotipos tetraploides de calidad que puedan usarse para las hibridaciones interploides. Por estas razones se ha tardado mucho tiempo en incorporar los conocimientos sobre obtención de triploides en programas de mejora amplios. Estos problemas se han podido resolver mediante biotecnologías basadas en el cultivo in vitro y en el análisis de ploidía mediante citometría de flujo.
El desarrollo de protocolos de cultivo in vitro de embriones de semillas abortadas o poco desarrolladas ha permitido resolver el primero de los problemas (Figura 6). Las semillas de pequeño tamaño se seleccionan de frutos maduros procedentes de los cruzamientos realizados y los pequeños embriones (alrededor de 1 mm de longitud) se aíslan en condiciones estériles con ayuda de un microscopio y se cultivan in vitro en un medio de germinación.
Alrededor del 84% de los embriones germina, produciendo plantas que se recultivan en un medio de elongación hasta que alcanzan el tamaño adecuado para su trasplante a invernadero.
El problema del análisis de ploidía para determinar si las plantas obtenidas son realmente triploides se ha resuelto mediante la utilización de la citometría de flujo (Figura 7). Para ello, se utiliza un trozo pequeño de una hoja de plantas cultivadas in vitro y se trocea muy finamente, en una solución de extracción de núcleos, junto a un trozo de hoja de tamaño similar de una planta control de ploidía conocida.
Se realiza la tinción de los núcleos con el colorante DAPI y la suspensión de núcleos teñidos se analiza con un citómetro de flujo. El equipo analiza la cantidad de ADN de los núcleos e integra los resultados mediante un programa informático en un histograma e indica el nivel de ploidía de las muestras introducidas. Esta tecnología permite determinar de forma muy fiable el número de cromosomas de una planta en unos diez minutos, en contraposición con las cerca de dos horas que se requieren para realizar el análisis mediante las técnicas histológicas clásicas, que, además, da en muchos casos resultados dudosos.
La obtención de parentales tetraploides se ha abordado mediante dos procedimientos. En las variedades poliembriónicas de cítricos, como se ha comentado anteriormente, ocasionalmente se producen autotetraploides espontáneos por duplicación de células de la nucela. En consecuencia, es posible obtener e identificar tetraploides analizando por citometría de flujo números elevados de plantas procedentes de semilla. El procedimiento se ha usado en el laboratorio para obtener plantas tetraploides de los siguientes genotipos: mandarinos Nova, Murcott, Afourer, Kara, Kinnow, Anana, Fairchild, Ortanique, Dweet, Común, Salteñita y Tardivo de Chiaculi, satsuma Frost, tangelo Minneola, limonero Eureka, lima Mejicana, pomelos Duncan y Star Ruby y naranjo Pinneaple. El único problema es que las plantas obtenidas tienen caracteres juveniles y deben transcurrir varios años antes de que inicien la floración y puedan usarse en programas de hibridación.
La obtención de tetraploides en variedades monoembriónicas se ha abordado mediante el tratamiento de ápices caulinares con colchicina y posterior regeneración de plantas mediante microinjerto in vitro. Este procedimiento nos ha permitido obtener por primera vez plantas tetraploides no quimericas de Clemenules y Marisol.
Otra metodología que se usa en pequeña escala para obtención de tetraploides es la fusión simétrica de protoplastos, que permite obtener híbridos somáticos que incorporan los genomas completos de ambos parentales, que en consecuencia son tetraploides.
La disponibilidad de estas biotecnologías nos permitió en 1996 iniciar un amplio programa de obtención de híbridos de mandarino triploides con el objetivo general de obtener nuevas variedades de maduración tardía, sin semillas y de elevada calidad.
Para ello se utilizan los tres tipos de cruzamientos antes indicados.
La mayoría de las variedades de cítricos son poliembriónicas y sus semillas producen varios embriones nucelares además del embrión sexual. Estas variedades no pueden usarse eficientemente en programas de mejora como parentales femeninos, porque es muy difícil la obtención de plantas a partir del embrión sexual. En consecuencia, en nuestro programa sólo usamos variedades monoembriónicas como parentales femeninos.
Para los cruzamientos 2n x 2n se realizó en primer lugar una prospección en el banco de germoplasma para determinar que genotipos producen gametos no reducidos y en consecuencia híbridos triploides espontáneos (Figura 3). En todos los casos estudiados la formación de los triploides espontáneos se produce con baja frecuencia. El mandarino Fortune mostró una eficiencia unas diez veces superior a las clementinas. En el programa de mejora se han usado fundamentalmente como parentales femeninos el mandarino Fortune y diversas variedades de clementino (Clemenules, Hernandina, Marisol, Fina, Monreal, Bruno, Guillermina, Loretina, Orogrande, Soyma y Tomatera) y en menor medida los mandarinos Ellendale, Encore, y Wilking. Esta aproximación tiene la ventaja de que el número de parentales masculinos disponibles que pueden utilizarse se amplía enormemente, lo que permite la elección de los mismos sobre la base de sus características agronómicas. En el programa del IVIA se han usado como parentales masculinos los clementinos Clemenules, Hernandina, Fina y Loretina, los mandarinos Fortune, Nova, Murcott, Ellendale, Común, Afourer, Ortanique, Freemont, Kara y Daisy, la satsuma Frost, los naranjos Comuna y Valencia, los tangelos Orlando y Minneola y el pummelo Chandler.
En total se han obtenido algo más de 3.800 híbridos triploides con este tipo de cruzamientos.
En los cruzamientos 2n x 4n se han usado diversas variedades de clementino (Clemenules, Hernandina, Fina, Marisol, Tomatera y Bruno) y el mandarino Fortune como parentales femeninos. Esta aproximación está limitada por el escaso número de parentales masculinos tetraploides de calidad disponibles y de hecho, cuando se inició el programa sólo disponíamos del tangelo Orlando tetraploide.
Como se ha indicado anteriormente hemos obtenido un número considerable de genotipos tetraploides de calidad que se están usando en el programa de hibridación en el momento que pierden los caracteres juveniles e inician la floración.
Además del tangelo Orlando, se han usado los mandarinos Nova y Común y el naranjo Pineapple tetraploides para obtener mas de 2.300 híbridos triploides mediante este tipo de cruzamientos. Está previsto realizar nuevos cruzamientos entre clementinos y los otros parentales tetraploides disponibles cuando estos inicien la floración.
Los cruzamientos 4n x 2n se han iniciado recientemente con la obtención de los clementinos tetraploides Clemenules y Marisol. Las primeras polinizaciones efectuadas han dado resultados muy prometedores y han permitido obtener mas de 700 híbridos usando los mandarinos Moncada, Murcott, Afourer y Kara, la satsuma Frost y el pomelo Star Ruby como parentales masculinos. La ventaja de este tipo de cruzamientos es que el número de parentales masculinos que puede usarse es muy elevado, que los híbridos tienen la mayor dotación genética procedente de los clementinos y que es más eficiente que los otros procedimientos. De hecho el programa se está enfocando en la actualidad casi exclusivamente a estos cruzamientos
Los tres tipos de cruzamientos representan aproximaciones complementarias. Los procedimientos usados son aparentemente lentos y poco eficientes. El numero de triploides que se obtienen por flor polinizada es de 0.3 en las polinizaciones 2n x 2n, de 0.9 en las polinizaciones y de 2.7 en las polinizaciones 4n x 2n. Sólo la aplicación de un gran esfuerzo por parte del grupo de trabajo ha permitido obtener desde el inicio del programa en 1996 más de 7.000 híbridos triploides de 147 combinaciones de parentales diferentes. El laboratorio está capacitado para obtener más de 1.000 híbridos triploides en un año (Figura 8).
El periodo para la obtención de un triploide desde la polinización hasta el trasplante al invernadero es de un año. Se requiere casi un año adicional hasta que las pequeñas plantitas crecen lo suficiente para obtener yemas para su propagación en las parcelas de evaluación
Los híbridos obtenidos están actualmente en fase de evaluación en campo (Figura 9). Esta es la parte más complicada del programa debido a la gran cantidad de datos que hay que tomar durante muchos años, lo que requiere la disponibilidad de parcelas y numeroso personal. De cada híbrido se efectúa una propagación sobre citrange Carrizo y se plantan a un marco de 2x4-5 m y en algunos casos incluso se doblan las filas. El muestreo es muy complicado debido a que cada híbrido tiene características diferentes y hay que elegir cuidadosamente el momento de la toma de los distintos datos necesarios para la evaluación. La complejidad se comprende si tenemos en cuenta que las filas de triploides tienen una longitud total de unos 15 kilómetros.
Una de las características de los híbridos de cítricos, tanto triploides como diploides, es que tienen caracteres juveniles, lo que implica que tardan varios años en florecer y fructificar y además tienen espinas grandes (Figura 10). Estos caracteres juveniles tardan normalmente varios años en desaparecer.
En nuestras condiciones el inicio de la floración de los triploides está siendo mucho más rápido de lo esperado, ya que a los cuatro años del injerto en campo el 88% de los triploides han iniciado la floración (Figura 11), cuando de acuerdo con datos de la bibliografía esperábamos que esta situación se alcanzase a los 7-8 años. Hasta ahora hemos realizado la evaluación inicial de las características de la fruta de los algo más de 1.600 híbridos que han fructificado (22% del total), de los que se han preseleccionado 80 híbridos prometedores para una evaluación secundaria más exhaustiva.
Para realizar esta evaluación los triploides seleccionados se sobreinjertan en árboles adultos situados en dos localizaciones diferentes.
Ninguno de los híbridos preseleccionados produce semillas, la mayoría son de maduración tardía y algunos de ellos tienen una fruta de calidad excelente (Figura 12 y 13). Antes de proceder a la entrega a los agricultores de algún híbrido es necesario confirmar en nuevas plantaciones los datos previos obtenidos y averiguar el comportamiento agronómico de los mismos en aspectos tan importantes como la productividad, posible vecería en variedades tardías y presencia de espinas (Figura 14), que es un factor muy importante desde el punto de vista agronómico. Además, en los híbridos que tienen Fortune como parental hay que comprobar su tolerancia o sensibilidad a Alternaria. En 2-3 años esperamos disponer de datos adicionales que nos permitan tomar decisiones sobre el inicio de la distribución de nuevas variedades.
Además de la caracterización agronómica se está efectuando una caracterización molecular con la finalidad de disponer de una "huella dactilar" de cada triploide seleccionado. Ello facilitara los procesos de protección de las variedades seleccionadas y permitirá un adecuado control de su propagación comercial.
Hay que indicar que en los programas de mejora de variedades de cítricos que se han realizado en el mundo, el periodo mínimo para la selección de nuevas variedades es de 20-25 años. En nuestro programa pretendemos acortar drásticamente estos plazos, pero sigue siendo imprescindible realizar una evaluación correcta y esperar a que las plantas pierdan los caracteres juveniles. Actualmente no existen procedimientos para acortar el periodo juvenil, que es impredecible y específico de cada híbrido.
La obtención de nuevas variedades de mandarinos se está orientando hacia los híbridos triploides en la mayoría de los países que realizan programas de mejora. El programa que se realiza en España es el más amplio y todos los años se realizan nuevas polinizaciones. Es previsible que a partir del momento en que se finalicen las primeras evaluaciones se liberarán nuevas variedades de forma continua.
Los datos disponibles en la actualidad indican que es posible obtener híbridos triploides que producen frutos sin semillas de excelente calidad y que además no polinizan a los clementinos (Figura 15).
En consecuencia, es previsible que las variedades de mandarino triploides se cultiven extensivamente en España en un plazo relativamente próximo.
