Desde hace 12 años, los laboratorios de Transformación Genética y Cultivo de Tejidos Vegetales del Departamento de Protección Vegetal y Biotecnología del IVIA, estamos trabajando en el desarrollo de la tecnología de transformación genética aplicada a cítricos y en investigar sus posibilidades de utilización para la mejora tanto de patrones como de variedades. Nuestra intención en este artículo es resumir las investigaciones llevadas a cabo y destacar los logros más importantes obtenidos hasta la fecha.
En el contexto de la imperiosa necesidad de mejora de nuestros cítricos para poder seguir siendo competitivos en los mercados internacionales, es necesaria la mejora genética y, entre las tecnologías existentes, la transformación genética de plantas ofrece enormes posibilidades, ya que permite introducir caracteres únicos en genotipos de élite sin alterar su fondo genético. Por ejemplo, se podría incorporar a naranjo amargo un gen (o unos pocos genes) de resistencia a tristeza, de manera que obtuviésemos un naranjo amargo resistente a este virus. Además, los caracteres de mejora no tienen que proceder necesariamente de cítricos, sino que pueden ser aislados de otros organismos vivos. Así se podría conseguir resistencia a ciertas plagas utilizando genes procedentes de bacterias.
Transformación genética de cítricos
Para transformar cítricos, utilizamos una bacteria del suelo llamada Agrobacterium tumefaciens. Es ésta una bacteria común que infecta a las plantas en lugares donde hay heridas produciéndoles agallas.
En la naturaleza, Agrobacterium transfiere un segmento de su ADN a las células vegetales y lo integra en su genoma. En el ADN transferido se encuentran varios genes que, una vez integrados en los cromosomas, la célula vegetal reconoce como suyos. Se dice que las células vegetales han sido transformadas. Entre ellos se encuentras genes implicados en la síntesis de hormonas, como auxinas y citoquininas. La producción de estas hormonas a gran escala por las células vegetales transformadas hace que se dividan y proliferen sin control y se formen las agallas.
Hoy en día, utilizando técnicas de ingeniería genética, se pueden retirar esos genes "nocivos" del genoma de Agrobacterium, es decir desarmar a Agrobacterium, y sustituirlos por otros genes de interés que queramos introducir en las plantas. Sin embargo, los cítricos no son huéspedes naturales de Agrobacterium. En efecto, esta bacteria no produce agallas en los cítricos en campo. Por lo tanto, lo primero que hemos tenido que hacer es una búsqueda para tratar de encontrar cepas de Agrobacterium que, en condiciones de laboratorio, fueran capaces de producir agallas al inocularlas en plantas de cítricos. Afortunadamente, hemos sido capaces de encontrar una cepa que produce agallas prominentes en los cítricos. Por tanto, podemos utilizar una derivada desarmada de esta cepa para introducir genes de interés en estas plantas.
Por otra parte, las técnicas de cultivo de tejidos vegetales in vitro permiten cultivar tejidos u órganos de las plantas, que se llaman explantes, en tubos de ensayo o en placas con medio de cultivo, en condiciones asépticas y ambientes controlados.
Los medios de cultivo contienen los nutrientes que permiten vivir a los tejidos vegetales en esas condiciones e incluyen básicamente sales minerales esenciales, una fuente de carbono (azúcar) y vitaminas. Se suelen gelificar suministrando agar. Si además añadimos hormonas a dichos medios, se produce la regeneración de plantas enteras a partir de una o muy pocas células del explante.
Se dice por ello que las células vegetales son totipotentes.
En el caso de los cítricos, cortamos varetas de plantas cultivadas en maceta en el invernadero. Desechamos las hojas y las espinas, esterilizamos las varetas con lejía diluida y las lavamos con agua.
Entonces, en condiciones asépticas, se cortan las varetas en segmentos transversales de nudos y entrenudos.
Los nudos se desechan y los entrenudos se utilizan como explantes. Estos se sumergen en un cultivo líquido de Agrobacterium tumefaciens desarmada portando los genes que queremos introducir en las células vegetales. Tras unos minutos, los explantes se sacan del cultivo bacteriano y se pasan a un medio de cultivo de tejidos vegetales, donde se tienen durante varios días. Durante este tiempo, la bacteria está transformando a las células que se encuentran en las zonas de corte de cada explante. Posteriormente, los explantes se pasan a otro medio de cultivo al que se añade un antibiótico para evitar la proliferación de Agrobacterium y hormonas que favorecen la regeneración de plantas a partir de las células transformadas de los explantes. Las brotes regenerados darán lugar a plantas transgénicas.
Es preciso aclarar aquí que Agrobacterium no es capaz, ni mucho menos, de transformar todas las células del explante. Son muy pocas las células que resultan transformadas. Entonces, ¿cómo sabemos que las plantas regeneradas proceden sólo de células transformadas? o, en otras palabras, ¿cómo podemos hacer para que regeneren plantas sólo a partir de las células transformadas?
Para ello, es necesario utilizar lo que llamamos agentes de selección que permitan proliferar sólo a las células transformadas en el medio de cultivo y que impidan el desarrollo de las células no transformadas. En la práctica, hacemos que Agrobacterium introduzca en las células junto al gen de interés otro gen que les confiere resistencia al antibiótico kanamicina, de modo que si añadimos este antibiótico al medio de cultivo sólo se desarrollarán plantas a partir de las células resistentes, es decir, de las células transformadas. Además de este gen de selección, introducimos un tercer gen (informador o delator) que nos permite identificar fácilmente las células transformadas y las plantas que regeneran a partir de ellas. Posiblemente, el gen informador que nos ha resultado más útil ha sido el gfp, que una vez introducido en las células, hace que éstas emitan fluorescencia verde cuando se observan bajo luz azul (Figura 1). Con la introducción por Agrobacterium de estos genes junto al gen de interés resulta relativamente fácil favorecer la regeneración únicamente de plantas transformadas.
Una vez regenerados, los brotes se pasan a otro medio de cultivo que contiene de nuevo los antibióticos para evitar la proliferación de Agrobacterium y de selección (kanamicina), y además se añaden hormonas para favorecer el enraizamiento.
En nuestra experiencia, los cítricos transgénicos enraízan in vitro con dificultad. Por ello, hemos desarrollado una modificación de la técnica de microinjerto para obtener plantas transgénicas rápida y eficazmente, evitando la necesidad de enraizarlas. En nuestro caso, lo que se injerta in vitro son brotes mucho más grandes que los que se usan para eliminar patógenos. De este modo, los brotes transgénicos se injertan sobre un patrón vigoroso que suele ser citrange Carrizo de unas dos semanas obtenido a partir de la germinación de una semilla en un medio de cultivo apropiado. Los injertos se mantienen en tubo de ensayo durante varias semanas. Tras prender el injerto y desarrollar la planta transgénica varias hojas nuevas, se injerta de nuevo, esta vez en el invernadero, sobre otro patrón vigoroso, de manera que a los pocos meses (4-6) de realizada la infección de los explantes por Agrobacterium se pueden conseguir plantas de unos 20 cm de longitud.
Mediante técnicas moleculares, confirmamos la presencia del gen de interés y su expresión en las plantas transgénicas regeneradas.
Situación de la transformación de cítricos en el IVIA
Aunque las primeras plantas transgénicas de cítricos que se obtuvieron en el mundo fueron desarrolladas por investigadores israelitas, japoneses y norteamericanos, los sistemas de transformación utilizados resultaron muy poco eficaces. En el IVIA empezamos a trabajar más tarde, pero la identificación de una cepa adecuada de Agrobacterium, la caracterización del tipo de células que resultan más aptas para la transformación, el desarrollo de me dios de cultivo que favorecen la aptitud celular, el desarrollo de sistemas de regeneración y selección eficaces, la utilización del microinjerto, la utilización de material vegetal de partida de una edad adecuada y en un estado fisiológico óptimo y la utilización de genes marcadores de selección e informador apropiados nos ha llevado a ser capaces de transformar de forma altamente eficaz un gran número de especies de cítricos entre los que se incluyen naranjo dulce, naranjo amargo, citrange, lima, limón, mandarino y Citrus macrophylla.
Ya se ha mencionado que el largo periodo juvenil de los cítricos es un obstáculo para su mejora genética. Recordemos que en nuestras condiciones los cítricos tardan entre 5 y 8 años para empezar a florecer y fructificar. Por eso nuestro siguiente objetivo fue tratar de transformar directamente cítricos adultos, para poder evaluar en unos pocos meses el efecto sobre la fruta del carácter introducido vía transgénica. Utilizamos dos estrategias. La primera consistió en la utilización de material vegetal de partida para transformar que procedía directamente de árboles adultos. De este modo, se consiguió la regeneración de plantas transgénicas que florecieron entre 1 y 2 años después de cultivar los segmentos de entrenudo con Agrobacterium. El procedimiento utilizado se encuentra patentado en España, EE UU y la Unión Europea. La segunda estrategia consistió en la incorporación en plantas juveniles de genes para acortar el periodo juvenil. Esos genes, llamados Leafy (LFY) y Apetala 1 (AP1) procedían de Arabidopsis thaliana, que es una planta modelo en experimentos de genética molecular, ya que tiene un genoma muy pequeño y ciclos reproductivos muy cortos. La transformación de cítricos juveniles con estos genes hizo que florecieran también entre 1 y 2 años después de realizar la inoculación con la bacteria (Figura 2). La progenie de esas plantas florece y fructifica incluso antes, 8 meses después de sembrar las semillas en el caso de plantas transgénicas AP1. Estas últimas investigaciones se han realizado en colaboración con investigadores del INIA de Madrid.
La presencia de genes marcadores de resistencia a antibióticos en las plantas transgénicas es un obstáculo para su comercialización. Algunos investigadores piensan que la presencia de este tipo de genes en los alimentos puede resultar peligrosa, aunque la mayoría no son de esa opinión.
De todos modos, es cierto que una vez han permitido la regeneración eficaz de sólo plantas transgénicas en los medios de cultivo adecuados su presencia en las plantas no tiene ninguna utilidad. Una directiva reciente de la UE prohíbe la presencia de genes de resistencia a antibióticos en alimentos que se comercialicen en Europa a partir del año 2005. Se han propuesto varios sistemas para eliminar este tipo de genes en las plantas transgénicas una vez han cumplido su función, pero la mayoría de ellas sólo son útiles para plantas herbáceas que se propagan por semillas. Se están investigando estrategias alternativas. En nuestro caso, recientemente hemos sido capaces de regenerar plantas transgénicas de cítricos sin utilizar el antibiótico kanamicina, gracias al seguimiento eficaz del proceso de transformación y la selección de las plantas regenerantes con el marcador informador de fluorescencia verde. Esto abre las posibilidades de obtención de cítricos transgénicos que no portarían ningún tipo de gen de resistencia a antibióticos.
Un requisito esencial para demostrar la validez de la tecnología de transformación genética para la mejora de los cítricos es la necesidad de que los genes incorporados a las plantas se mantengan y expresen en los mismos de manera estable durante los largos períodos de tiempo que éstas van a estar en el campo sometidas a muy diversas condiciones ambientales. Por ello, en el IVIA hemos plantado en campo una serie de unos 50 árboles transgénicos de diferentes especies de cítricos (Figura 3) que sólo portan genes marcadores y actualmente estamos investigando el comportamiento de los árboles en campo y la estabilidad de la expresión de los genes foráneos. La normativa española y europea no permite la liberación al ambiente de plantas transgénicas si antes no se ha solicitado y conseguido un permiso, en el que se ha de detallar información referente a los genes introducidos, metodología utilizada para transformar las plantas, biología de las plantas modificadas, análisis de riesgos de la liberación, etc. La liberación de cítricos transgénicos en el IVIA se aprobó en 1996 por el Ministerio de Medio Ambiente con el permiso nº B/ES/96/15, está de acuerdo con la normativa europea según el artículo 9 de la Directiva 90/220 y se realizó en 1997. Es la primera vez que se han plantado cítricos transgénicos en campo en el mundo.
Incorporación de genes de posible interés en los cítricos
Puesto que ya hemos establecido sistemas eficaces de transformación genética de cítricos, podemos abordar ahora la incorporación de genes de posible interés en estas plantas. En este sentido, (aparte de los genes LFY y AP1 de Arabidopsis thaliana mencionados antes) hemos introducido en plantas de naranjo dulce un gen aislado de tomate que produce una proteína antifúngica para tratar de hacerlas más tolerantes a Phytophthora (Figura 4), que es el hongo causante de la gomosis y del aguado de los cítricos, hemos introducido genes implicados en el metabolismo de giberelinas en citrange Carrizo con la intención de tratar de modular el tamaño de las plantas, hemos incorporado en varias especies de cítricos genes de insensibilidad a etileno para tratar de controlar la abscisión, y estamos introduciendo genes del virus de la tristeza de los cítricos en diferentes cítricos para investigar la biología del virus y sus interacciones con la planta huésped con la finalidad última de tratar de obtener resistencia a tristeza. Todas estas investigaciones están en curso y se están realizando en colaboración con investigadores expertos en todos estos campos, tanto del IVIA como de otros centros públicos de investigación como el Instituto de Biología Molecular y Celular de Plantas del CSIC y de la Universidad Politécnica de Valencia.
El desarrollo en los últimos tiempos de proyectos de secuenciación de genomas completos de muchos organismos vivos, entre los que se incluyen plantas como Arabidopsis, arroz, maíz, etc., nos llevará probablemente al aislamiento de genes homólogos en cítricos y a poder investigar su funcionalidad en estas plantas. Con ello, se podrá hacer una mejora vía transgénica mucho más dirigida y eficaz. En definitiva, disponemos de las tecnologías más avanzadas en transformación genética de cítricos y, aunque a corto plazo no se prevé la obtención de genotipos transgénicos que se puedan comercializar, en el futuro no dependeremos de las tecnologías desarrolladas por otros países.
Por tanto, estamos en posición de cabeza y lo más interesante está por venir. Sin embargo, no podemos olvidar que el desarrollo futuro de esta tecnología depende en gran medida del interés y el apoyo de agricultores y consumidores, que al fin y al cabo tienen que ser, y son, los principales beneficiarios de nuestras investigaciones.
