Actualmente el empleo de agua destilada es una práctica muy habitual en experimentos que se llevan a cabo en los laboratorios. En la destilación del agua por métodos tradicionales no se elimina completamente el cloro que contiene el agua potable que ha sido sometida a un tratamiento de cloración para su desinfección. La naturaleza de los productos fitosanitarios se puede ver afectada cuando se emplea para los estudios agua destilada que contenga residuos de cloro.
En este trabajo se ha estudiado la reacción entre tres herbicidas de la familia de las ciclohexanodionas y agua destilada que contiene cloro residual con el fin de determinar el comportamiento de estos herbicidas.
Asimismo, se pone de manifiesto el problema que puede suponer el empleo de agua destilada ya que puede dar lugar a resultados erróneos debido a la reacción que tiene lugar entre los productos fitosanitarios y el cloro residual.
La destilación del agua es una práctica muy habitual en muchos laboratorios. El agua destilada se emplea en casos donde sea necesario el uso de una matriz acuosa. De esta manera su uso es muy amplio y se emplea tanto en la preparación de los estándars de los productos fitosanitarios como en la preparación de las muestras en multitud de estudios como pueden ser entre otros; el desarrollo y validación de métodos analíticos (HU et al., 1999), preparación de soluciones en los cultivos hidropónicos (OSBORNE et al.., 1995) y para estudiar en disolución acuosa el efecto de factores como el pH, luz, materia orgánica? (AL-MUGHRABI et al., 1992; MANSOUR et al., 1997) en productos fitosanitarios.
En el agua clorada se establece el siguiente equilibrio; En la destilación se separan sustancias que tiene el agua en solución, suspensión y sólidos y a pesar de lo que erróneamente se cree no se elimina completamente el cloro. El cloro en forma de cloro libre y cloro combinado puede aparecer en el destilado en cantidades apreciables.
Esto también ocurre con las cloraminas que es el método de desinfección empleado en la Comunidad de Madrid. La eliminación del cloro se puede llevar a cabo con tratamientos empleando tiosulfato sódico, carbón activo o resinas de intercambio iónico.
El problema del cloro en el agua destilada empleada en laboratorio se puso de manifiesto en el campo de la química clínica cuando en 1958, Caraway observó que algunos procesos de destilación podían dar lugar a la contaminación con cloro del agua destilada (CARAWAY, 1958). Observó que 1 ppm de cloro libre en agua destilada inhibía el color en las determinaciones de ácido úrico, bilirrubina y otras determinaciones clínicas, dando lugar a resultados erróneos. Collier y Stinson (1972) desarrollaron un método para eliminar el cloro del agua destilada para su empleo en laboratorios clínicos, debido a los falsos positivos que los bioquímicos obtenían debido a la presencia de cloro. Estos autores enfatizaron sobre la importancia de analizar químicamente la calidad del agua destilada, ya que en la mayoría de los casos se ignora la presencia del cloro. Por otro lado, también ponen de manifiesto que el almacenamiento del agua destilada en contenedores de plástico puede dar lugar a su contaminación con microorganismos que interfieren con las reacciones que se están estudiando.
Los trabajos realizados sobre el efecto que puede tener el cloro en los productos fitosanitarios no ha sido estudiado en el caso concreto de que la matriz acuosa sea agua destilada, sino que en la mayoría de los estudios se han centrado en el agua potable que haya sido sometida a tratamientos con cloro para su desinfección, debido al riesgo que puede suponer estos compuestos para la salud pública. Asimismo, se ha investigado en los productos generados en estas reacciones ya que la transformación de estos compuestos da lugar a productos de degradación desconocidos y cuya toxicidad se desconoce. Así, algunos organofosforados son fácilmente degradables por cloración dando lugar al oxón (WU y LAIRD, 2003), que en algunos casos tiene mayor toxicidad que la sustancia activa (ROMPAS et al., 1989). Con respecto a los herbicidas, estudios sobre fenilureas, como el clortolurón (LOSITO et al., 2000) y el isoproturón (LÓPEZ et al., 1997) se degradan rápidamente, dando lugar a productos de degradación clorados e hidroxilados. Tambien algunas metiltio-s-triazinas, como la ametrina (LÓPEZ et al., 1997) y la terbutrina (LÓPEZ et al., 1998), así como las carbamoiloximas, aldicarb y metomilo (MILES, 1991a), se degradan rápidamente con cloro, dando lugar al sulfóxido como primer producto de degradación, seguido de reacciones de cloración e hidrólisis.
En el caso de las ciclohexanodionas son escasos los trabajos realizados sobre su degradación con agentes empleados en la desinfección del agua. Debido a la baja repetibilidad que se obtenía en bioensayos realizados con el herbicida tepraloxidim cuando se empleaba agua clorada, se llevó a cabo un estudio de su estabilidad, donde se observó que el tepraloxidim tenía una vida media menor de 1 hora en agua potable y menor de 5 horas en una solución de cloraminas (SANDÍN-ESPAÑA et al., 2003). Asimismo, estudios realizados con otros herbicidas ciclohexanodionas como aloxidim, tralkoxidim y cletodim con hipoclorito sódico mostraron la rápida degradación de estos compuestos con vidas medias menores a los 2 minutos (SANDÍN-ESPAÑA et al., 2005).
Las ciclohexanodionas (CHD) comúnmente conocidas como DIM´s, son herbicidas introducidos a principios de la década de los ochenta del pasado siglo, como herbicidas selectivos de post-emergencia para el control de malas hierbas gramíneas en cultivos de cereales. Estos herbicidas, son generalmente activos a bajas concentraciones y presentan una baja toxicidad, lo cual hace que puedan ser ampliamente utilizados.
Su vía de absorción es foliar y se translocan a los meristemos donde inhiben la acetil-CoA.carboxilasa (ACCasa), enzima que cataliza el primer paso común para la síntesis de ácidos grasos (INCLEDON et al., 1997).
En cuanto a su estructura química, además del anillo ciclohexano-1,3-diona, es esencial para la actividad fitotóxica el grupo etoxiimino unido en la posición 2 del anillo (LICHTENTHALER, 1990). En la Figura 1 se muestran las estructuras químicas de los compuestos pertenecientes a esta familia que se han estudiado.
El objetivo del presente trabajo es el estudio del efecto del cloro residual del agua destilada en herbicidas de la familia de las ciclohexanodionas (cletodim, setoxidim y profoxidim) (Figura 1) y de cómo afecta en su estabilidad la variación en el contenido de cloro presente en el agua destilada.
Material y métodos
Patrones y disolventes
Los patrones analíticos de setoxidim ((±)-(EZ)-2- (1-etoxiiminobutil)-5-(2-etilsulfanilpropil)-3-hidroxi-2-ciclohexenona, 99,3%) y profoxidim (2-(1-[2-(4-clorofenoxi)propoxiimino]butil)-3-hidroxi-5- (tetrahidro-2H-tiopiran-3-il)-2-ciclohexenona), 99,6%) (Figura 1) fueron suministrados por BASF Ltd (Limburgerhof, Alemania). Los patrones de cletodim (2-((E)-1-((E)-3-cloroalliloxiimino)propil)-5-(2-etilsulfanilpropil)-3-hidroxi-2-ciclohexenona, 98%) (Figura 1) fueron obtenidos de ChemService (West Chester, PA, USA).
Todos los disolventes empleados para preparar las muestras estándar en los estudios de estabilidad y durante el análisis cromatográfico fueron de grado HPLC. Como disolventes para la cromatografía líquida se emplearon acetonitrilo y agua de grado HPLC suministrados por Lab-Scan (Stillorgan, Co. Dublín, Irlanda). El ácido fórmico (grado analítico, 98%) fue obtenido de la casa comercial Panreac (Barcelona, España). Para estudiar la estabilidad de los herbicidas se empleó agua recién destilada, que se almacenó en un bidón de 10 litros.
Durante el tiempo que duró el estudio, este bidón permaneció abierto para favorecer la evaporación del cloro.
Se prepararon disoluciones patrón de 50 mg/l de los herbicidas y se almacenaron en oscuridad a 4ºC y fueron usadas para preparar soluciones más diluidas para la calibración y para los estudios de estabilidad. Los patrones de cletodim se pesaron y se disolvieron en la mínima cantidad de acetonitrilo en un matraz aforado, enrasándose hasta el volumen deseado con agua. Las disoluciones son estables durante 10 días. La disolución de setoxidim se pudo preparar directamente disolviéndolo en agua gracias a la alta solubilidad de este compuesto y loas disoluciones son estables al menos durante 3 meses. Los patrones de profoxidim se prepararon disolviéndolos en la mínima cantidad de metanol, debido a su baja solubilidad en otros disolventes como acetonitrilo y acetona, y enrasándose hasta el volumen deseado con agua. Las disoluciones de profoxidim son estables durante 1 mes.
Equipos
El estudio de la estabilidad de estos herbicidas se llevó a cabo mediante un cromatógrafo de líquidos HPLC Agilent serie 1.100 con bomba cuaternaria (modelo G1354A), muestreador automático (modelo G1313A), detector de diodo array (modelo G1315B) (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA). Los datos cromatográficos fueron recogidos y analizados mediante la estación de datos LC 3D (modelo G1319A). Los compuestos se separaron mediante una columna Nova-Pack C18 (150 x 3.9 mm, 4 ?m de partícula) suministrado por Waters (Milford, MA, USA).
El volumen de inyección fue en todos los casos de 50 ?l y la longitud de onda fue la máxima obtenida para cada herbicida.
La concentración de cloro residual se midió con el test colorimetrico Microquant® suministrado por Merck (Darmstadt, Alemania). Se determinó el cloro total, es decir la suma de cloro libre (cloro elemental disuelto en el agua como ácido hipocloroso (HClO) y como ión hipoclorito (ClO-)) y cloro combinado (cloro que esta presente en forma de cloraminas).
La destilación del agua se llevo a cabo con un destilador automático Modelo 702 suministrado por Pobel, (Madrid, España).
Estudios de estabilidad en agua destilada
En este trabajo se ha estudiado en primer lugar el efecto que tiene el cloro residual presente en el agua destilada en los tres herbicidas ciclohexanodionas y en segundo lugar como varia la estabilidad de dichos herbicidas a lo largo de los días, según va disminuyendo la concentración de cloro debido a su evaporación.
Para ello, se recogieron 9 litros de agua recién destilada en un bidón de 10 litros de capacidad. Dicho bidón se dejó abierto durante los días en los que se desarrolló el experimento. Cada día se analizaron las muestras con el agua destilada del bidón.
La concentración de cloro se midió diariamente.
Los dos primeros días el agua destilada tenía una concentración en cloro residual de 0,5 ppm.
El día 11 la concentración fue de 0,25 ppm, y alcanzó 0,1 ppm el día 14. A partir del día 18 no se observó presencia de cloro residual en el agua destilada según el test colorimétrico.
La duración del experimento fue de 18 días, cuando la concentración de los herbicidas en solución con agua destilada fue estable, coincidiendo así con la del blanco control correspondiente a ese día y cuando fue completa la desaparición del cloro en el agua destilada.
Las reacciones que tienen lugar entre los herbicidas y el cloro fueron estudiadas empleando una proporción herbicida:cloro 1:1 (mol/mol) en función de la concentración inicial de cloro en el agua destilada. Para ello se dispusieron en viales independientes 500 ml de la disolución de herbicida a los que se les adicionaron alícuotas de 500 ml de agua destilada. Se realizaron tres repeticiones. Dichos viales fueron encapsulados y analizados mediante cromatografía de líquidos. Cada día se realizaron blancos con 500 ml de la disolución de herbicida y 500 ml de agua HPLC. De esta forma se controla una posible degradación del herbicida por otros procesos que no sean debidos a la acción del cloro como fotodegradación o hidrólisis. También se analizó un blanco con agua destilada en las condiciones cromatográficas de cada herbicida para comprobar que no existía alguna interferencia con la elución de los herbicidas.
Para ver el tiempo en el que tenia lugar la reacción entre el herbicida y el cloro presente en el agua destilada, se realizo un ensayo previo en el cual se analizaron las muestras en el momento de prepararse solución, en horas y días sucesivos, observándose que la reacción tenia lugar en varias horas en las cuales se observaba una disminución en la concentración de herbicida. La concentración de herbicida que ya no reaccionaba con el cloro presente fue estable a partir del día siguiente a la realización de la disolución por lo que se tomaron datos de la concentración de herbicida en el momento de preparar la disolución y al día siguiente.
Para el análisis cromatográfico se tomaron 50 ?l de muestra después de detener la reacción y se inyectaron por duplicado en el sistema cromatográfico.
El flujo fue en todos los casos de 1 mL/min. La fase móvil fue acetonitrilo/agua con un 0,1% de ácido fórmico. En ninguno de los tres herbicidas fue necesario el empleo de preconcentración de muestra, ya que las concentraciones de los herbicidas fueron suficientemente altas para ser detectadas por el equipo.
La concentración de los herbicidas fue calculada por comparación del área de los picos con aquellas obtenidas de las soluciones estándar. La calibración externa se realizó inyectando las soluciones estándar de concentración conocida en el cromatógrafo de líquidos en las mismas condiciones.
Resultados y discusión
Las condiciones cromatográficas empleadas para el estudio cinético de degradación de cada herbicida así como el tiempo de retención obtenido se muestra en la Tabla 1.
Para conocer la concentración de los herbicidas en cada momento del estudio cinético se calcularon las rectas de calibración entre 5.10-3 y 5 ppm para el cletodim y setoxidim (n = 10) y entre 1.10 -2 y 5 ppm para el profoxidim (n = 9), (Tabla 2).
La longitud de onda máxima del cletodim en estas condiciones fue de 196 y 254, para el profoxidim 194 y 230, y para el setoxidim 210 y 255. A pesar de la absorción era máxima en 196 y 194 nanómetros para el cletodim y el profoxidim respectivamente, se escogieron para su estudio las longitudes de onda de 254 para el cletodim y 230 para el profoxidim, debido a las interferencias que presentaban los disolventes a esas longitudes de onda que dificultaban la correcta cuantificación de los herbicidas.
En estas condiciones el límite de detección para el cletodim fue de 5 ppb, 5 ppb para el setoxidim y 10 ppb para el profoxidim.
Estudio de estabilidad del cletodim
Durante los días que se realizó el estudio el análisis diario de los blancos no mostró degradación de las disoluciones patrón de cletodim. No se observó interferencia del agua destilada en las condiciones cromatograficas de elución de este herbicida.
Como se puede observar en la Figura 2 el primer día que se destila agua se produce la completa degradación del herbicida. Al día siguiente la concentración de cloro en el agua destilada se mantiene igual y también tiene lugar la completa degradación del herbicida. A partir del tercer día la concentración de cloro total en el agua empieza a disminuir debido a su evaporación, lo que da lugar al aumento progresivo de la concentración de cletodim en la disolución. Doce días después de destilar el agua, el herbicida alcanza el 50% de su concentración.
A partir del día 18 la ausencia de cloro en el agua destilada hace que no produzca degradación del herbicida.
Con respecto a los productos que se forman en la reacción que tiene lugar con el cloro, se observó la aparición de productos de degradación que eluían a tiempos de retención muy cortos y que aparecían como una mezcla de varios productos (Figura 3), cuya concentración iba disminuyendo según la concentración de cloro disminuía y aumentaba la del cletodim.
Estudio de estabilidad del setoxidim
Durante los días que se realizó el estudio el análisis diario de los blancos no mostró degradación de las disoluciones patrón de setoxidim. No se observó interferencia del agua destilada en las condiciones cromatográficas de elución del herbicida.
Como se puede observar en la Figura 4 el primer día que se destila agua se produce la completa degradación del herbicida. Durante los dos días posteriores a la destilación, la degradación del herbicida fue también completa. A partir del cuarto día, la degradación del herbicida no es total y su concentración va aumentando progresivamente a medida que la concentración de cloro va disminuyendo.
Trece días después de destilar el agua, el herbicida alcanza el 50% de su concentración y al igual que ocurría con el cletodim, a partir del día 18 el herbicida es estable en el agua destilada.
Con respecto a los productos de degradación que se forman, al igual que en el cletodim, se observan unos compuestos más polares que la sustancia activa y que eluyen a tiempos de retención muy cortos en las condiciones del método cromatográfico.
Estos productos fueron disminuyendo su concentración a lo largo de los días donde disminuían la concentración de cloro y aumentaba la del herbicida.
Estudio de estabilidad del profoxidim
Durante el intervalo de días que se realizó el estudio el análisis diario de los blancos no mostró degradación de las disoluciones patrón de profoxidim. No se observó interferencia del agua destilada en las condiciones cromatográficas de elución del herbicida.
Como se puede observar en la Figura 6 desde el primer día que se destila agua y los cuatro días posteriores, se produce la completa degradación del profoxidim. A partir del sexto día el profoxidim empieza a no degradarse completamente y durante los días posteriores continúa un aumento progresivo de la concentración de profoxidim en la disolución a medida que se va evaporando mayor proporción del cloro total en el agua. La concentración del herbicida es del 50% en el día 13, y al igual que ocurría con los dos herbicidas estudiados, setoxidim y cletodim, en ausencia de agente oxidante, el profoxidim es estable en el agua destilada.
En el caso del profoxidim también se observó que su degradación da lugar a varios productos de degradación que aparecen muy cerca del frente cromatográfico y que con el método cromatográfico existente no era posible discriminar.
Conclusiones
Los herbicidas ciclohexanodionas estudiados presentan un átomo de azufre en su estructura. Una de las más importantes rutas degradativas de productos fitosanitarios que contienen azufre es la oxidación a sulfóxido y sulfona. Esta reacción es conocida para productos fitosanitarios como el aldicarb, carboxim y fenamifos (MILES, 1991b). En la mayoría de los casos, los productos resultantes de la reacción de sulfoxidación, sulfoxido y sulfona, tienen también actividad pesticida. Con respecto a estos herbicidas ciclohexanodionas, en nuestro grupo de trabajo se ha realizado la degradación del cletodim con agua clorada mediante hipoclorito sódico, identificándose los productos de degradación sulfóxido y sulfona (datos no publicados). Posiblemente los productos que se formen en esta reacción con agua destilada también sean productos generados de la sulfoxidación.
A la vista de los resultados obtenidos de este estudio, se puede concluir que los herbicidas ciclohexanodionas estudiados se degradan de manera muy rápida en agua destilada que contiene cloro. El cloro residual presente en el agua destilada de 2,3 y 5 días degrada completamente a los herbicidas cletodim, setoxidim y profoxidim respectivamente en las condiciones estudiadas. Es dieciocho días después de la destilación del agua cuando estos herbicidas son estables en el agua destilada. El empleo de agua destilada en estudios de laboratorio puede dar lugar a una disminución de la eficacia y por lo tanto a resultados erróneos debido a su degradación. Por lo tanto, cuando se estudien estos herbicidas en laboratorio, debe asegurarse que el agua empleada esté libre de cloro.
Paralelamente a la degradación del herbicida con el cloro residual, se están formando productos de transformación que se desconoce su posible fitotoxicidad cuando se emplea agua destilada para la preparación de los ensayos de laboratorio. Actualmente, la separación e identificación de estos productos de degradación se están estudiando en nuestro grupo.
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