El diseño de protocolos de diagnóstico y detección de virus de especies leñosas implica no sólo la producción de reactivos (anticuerpos, sondas, cebadores...) específicos y la puesta a punto de técnicas sensibles. El establecimiento de la época, periodo vegetativo y órganos ideales a muestrear, es esencial para lograr detecciones y diagnósticos fiables. Algunos métodos de diagnóstico han permitido popularizar la detección de virus. Su aplicación sistemática para realizar prospecciones, controles de la producción, selección sanitaria, erradicación y estudios epidemiológicos, han sido definitivos para el control de algunas virosis graves y para ayudar al productor en la toma de decisiones. En el presente artículo se analizan las repercusiones de la existencia de protocolos fiables y de datos surgidos de estudios epidemiológicos, en el control del virus de la sharka de los frutales de hueso y del virus de la tristeza de los cítricos en España. Se discute la importancia y repercusión de los métodos de detección de calidad con dos ejemplos: el programa de erradicación del virus de la sharka agresivo en melocotonero, tipo M, y la reconversión citrícola provocada por la enfermedad de la tristeza.
Los virus de la sharka y de la tristeza y su importancia económica
El agente responsable de la enfermedad de la sharka (viruela en idioma búlgaro) es el Plum pox virus (PPV) que provoca la enfermedad viral más grave del albaricoquero, ciruelo y melocotonero, no sólo por la importancia de las pérdidas económicas que produce, sino también por tratarse del único virus de frutales de hueso que se dispersa de forma natural por pulgones. PPV está considerado como virus de cuarentena por lo que el movimiento de material vegetal de zonas con árboles infectados, está sujeto a controles, obligando a los países que no lo poseen a tomar drásticas medidas para evitar su introducción y a los países en los que está presente a tomar precauciones especiales que eviten su dispersión y la introducción de nuevas cepas o aislados del virus. La epidemia de PPV se originó en el este de Europa.
La enfermedad fue descrita por vez primera en Bulgaria en 1917 en ciruelo europeo y en 1933 en albaricoquero. Desde entonces se ha dispersado por toda Europa (en España se detectó en 1984 por LLÁCER et al., 1985 y LLÁCER Y CAMBRA, 1986), la mayoría de países del Mediterráneo y Oriente Medio, y más recientemente en algunos países del continente americano (Chile, Estados Unidos y Canadá). El virus de la sharka posee varios tipos entre los que destacan como mayoritarios: el tipo Dideron, común o D (agresivo en albaricoquero y ciruelo europeo) y el tipo Marcus o M (agresivo en melocotonero, albaricoquero y ciruelo). Además, se han descrito el tipo C (que puede infectar a guindo y cerezo dulce), los tipos El Amar (EA) y otros aislados atípicos encontrados en Turquía, Egipto y más recientemente en Canadá.
Los síntomas de la enfermedad en frutales de hueso y en especies ornamentales del género Prunus, dependen del aislado del virus. Los aislados comunes o tipo D pueden afectar al albaricoquero, ciruelo y melocotonero; pero no obstante los daños más graves son causados en albaricoquero, especialmente en las variedades más precoces. Los primeros síntomas aparecen en algunas hojas en forma de anillos y manchas cloróticas en primavera. Los albaricoques presentan anillos hundidos y deformaciones externas que se corresponden con acumulaciones gomosas en el mesocarpio.
Los frutos suelen caer precozmente y además presentan mal sabor, lo que los hace inservibles incluso para la industria alcoholera. Los síntomas en la piel del fruto se corresponden con manchas tipo "ojo de perdiz" y anillos en la semilla o hueso que son característicos de la enfermedad. Los aislados tipo M inducen los mismos daños que los D en albaricoquero (que ya son graves), pero afectan con más gravedad al ciruelo europeo y melocotonero que los aislados tipo D, desconociéndose la sintomatología sobre ciruelo japonés.
Los síntomas foliares son más evidentes y frecuentes, y además los tipos M provocan decoloración de los pétalos de las flores de algunas variedades de melocotonero (incluido el nectarino), especialmente si éstas son de color rosa. Los frutos de melocotonero, ciruelo y los de albaricoquero se deforman, presentan anillos muy marcados y suelen caer antes de la madurez. Así pues, los aislados PPV-M son agresivos para el cultivo del melocotonero, albaricoquero y ciruelo.
La sharka tipo M se transmite muy fácilmente entre melocotoneros y entre nectarinos y de ellos a ciruelos y albaricoqueros. Cuando el tipo M está presente, la enfermedad avanza considerablemente en melocotoneros. En las condiciones españolas Aphis spiraecola, A. gossypii y Myzus persicae son los principales vectores responsables de la dispersión de la enfermedad a corta y media distancia. No obstante, el hombre, con el tráfico incontrolado de material vegetal, es el principal causante de la dispersión de la enfermedad a larga distancia.
La sharka constituye un problema en España fundamentalmente en las zonas de cultivo de albaricoquero, en las que además se cultive ciruelo japonés, así en Murcia y Comunidad Valenciana. En ambas comunidades se realizan programas de erradicación voluntaria (o de reducción de inóculo) que han supuesto el arranque subvencionado de más de 1.500.000 árboles. Ello no ha logrado la erradicación de la enfermedad que continúa presente en plantaciones de ciruelo japonés debido a que no causa daños de suficiente importancia económica para justificar su arranque, y de ellas se dispersa a albaricoqueros.
La enfermedad está presente, con incidencia muy variable, en todas las zonas de cultivo de frutales de hueso de España, excepto en Aragón y Navarra donde no se cultiva el ciruelo japonés y se han efectuado sistemáticos arranques de las plantas infectadas desde 1984, fecha de detección del virus en España. Se han realizado estudios epidemiológicos en algunas zonas españolas (GOTTWALD et al., 1995). Los tipos M (agresivos en melocotonero) nunca habían sido detectados en España hasta la fecha. Estos tipos están presentes, y son mayoritarios, en la casi totalidad países de Europa central y del este incluyendo a países mediterráneos como Grecia. Además, PPV-M está presente en el sur de Francia, a pesar de los esfuerzos de erradicación que se realizan, y se encuentra muy generalizado en Italia donde se ha dispersado con gran velocidad desde su introducción hace menos de una década.
El riesgo de introducción de PPV-M desde países mediterráneos como Francia e Italia es muy elevado ya que se mantiene con ellos un constante intercambio de material vegetal y es demasiado frecuente el tráfico incontrolado de yemas de variedades de melocotonero de interés para nuestras latitudes, procedentes de plantaciones comerciales extranjeras, y por tanto, sin garantías sanitarias. Como consecuencia del exhaustivo seguimiento de la enfermedad, que se lleva a cabo en plantaciones comerciales de Aragón, en el mes de junio de 2002, se detectó el tipo Marcus o M del virus en una plantación de melocotonero situada en el término municipal de Caspe (Zaragoza), lo que supone la primera detección de esta cepa en España (CAMBRA et al., 2003). La detección se produjo en árboles de la variedad de melocotonero Royal Gem de origen desconocido (no producidos en viveros autorizados) e introducidos en la zona. Una vez detectado y caracterizado el tipo M por el Centro de Protección Vegetal de Zaragoza, se confirmó su diagnóstico en el Laboratorio de Referencia de la Subdirección General de Sanidad Vegetal del MAPA (IVIA, Moncada-Valencia) para virus de especies leñosas. El tipo detectado se comporta de una forma agresiva, mostrando síntomas evidentes tanto en hojas como en frutos de melocotonero.
Además, se ha constatado su fácil transmisión por pulgón. Tras la detección y diagnóstico, se iniciaron prospecciones intensivas con objeto de conocer el porcentaje real de infección y la extensión de la enfermedad y se adoptaron rápidamente medidas de erradicación en cumplimiento de la normativa vigente para organismos de cuarentena (Real Decreto 1.190/98, BOE 141 de 13 de junio de 1998). En la actualidad, tras intensas prospecciones en 2003 y 2004, no se han observado síntomas en los cultivos susceptibles de la zona. Si en 2005 tampoco se observaran, el virus PPV-M podría oficialmente ser declarado como erradicado de España. El virus de la tristeza de los cítricos (CTV) provoca la enfermedad viral más importante del cultivo debido a la gravedad de sus síntomas y a su fácil dispersión por pulgones y por injerto.
Este virus ha puesto en peligro a la importante citricultura española desde su introducción, probablemente desde California (EE UU), con material vegetal asintomático pero infectado. En efecto, en los primeros años de la década de 1930 se importaron plantas y yemas, con destino a una citricultura cada vez más importante económicamente y por tanto, en expansión. La citricultura mediterránea, estaba basada casi exclusivamente en el uso del patrón naranjo amargo o agrio, cuya combinación con naranjo dulce, mandarino, lima o pomelo (excepto con limonero), resulta sensible a la enfermedad de la tristeza. CTV provoca una degeneración del floema de la variedad y del patrón naranjo amargo a nivel de la línea de injerto y los árboles injertados sobre dicho patrón, decaen al infectarse, conforme la cantidad de floema no funcional va en aumento. De ahí el nombre de tristeza ya que los árboles se marchitan y llegan a morir. Este decaimiento puede ser lento (sucediendo a lo largo de meses o pocos años) o repentino (unos días) tipo colapso. Al final, los árboles mueren o quedan improductivos con cosecha inferior a la normal y frutos de menor calibre.
En 1957, tras una helada importante en la comarca de La Ribera Alta de Valencia en el año anterior, se produjo la primera muerte masiva de árboles injertados sobre naranjo amargo en España, unos 20 años más tarde de la introducción del virus. A estas explosiones epidemiológicas siguieron otras. Desde entonces hasta ahora, se estima que más de 40 millones de árboles, la mayoría naranjos dulces y mandarinos, injertados sobre naranjo amargo han muerto en España, según evaluación reciente de Cambra et al., (2000a). En el período desde 1930-35 hasta 1989 se calcula que unos 20 millones de árboles fueron destruidos por la enfermedad de la tristeza en España.
En esta época la dispersión del virus se produjo fundamentalmente por el tráfico incontrolado de material vegetal y la práctica del sobreinjerto con variedades portadoras del virus pero asintomáticas. También los pulgones Toxoptera aurantii y Aphis spiraecola, contribuyeron a dispersar la enfermedad al alimentarse primero en árboles infectados y posteriormente visitar y alimentarse de nuevo en árboles sanos. Estos dos vectores aún siendo muy abundantes en la época, son poco eficaces en transmitir la enfermedad.
Desde 1989 hasta la actualidad, se ha evaluado en más de 20 millones de árboles injertados sobre naranjo amargo, las pérdidas provocadas por CTV. En este período el eficaz vector A. gossypii (pulgón del algodonero) se ha hecho predominante y ha favorecido un considerable avance de la enfermedad. El eficaz vector Toxoptera citricida (pulgón café) todavía no está presente en España, pero su reciente detección en la región portuguesa de Entre-Douro e Minho en septiembre de 2004 (OEPP, 2004), hace temer una inminente introducción en España. Su instauración provocaría no sólo la aparición de una grave plaga para los cítricos, amén de otras complicaciones legales (organismo de la lista EPPO A1), sino además, una dispersión más rápida del virus en zonas con baja incidencia como Andalucía, donde todavía quedan numerosos árboles sobre naranjo amargo.
A tenor de las cifras comentadas hasta ahora España es el país del mundo donde mayor número de árboles injertados sobre naranjo amargo han muerto debido a CTV. Se estima que todavía quedan unos 15 millones de árboles sobre patrón amargo. Estos también morirán o desaparecerán en los próximos años, como consecuencia de la reconversión a una citricultura moderna basada en el uso de variedades libres de virus injertadas sobre patrones que inducen una combinación tolerante a la enfermedad de la tristeza, o muertos directamente por la acción del virus que sería dispersado a nuevas zonas por la posible introducción de T. citricida.
Breves antecedentes de la lucha contra la sharka y la tristeza en España. Repercusión de los métodos de diagnóstico
La lucha contra el virus de la sharka, desde su primera detección en 1984, ha consistido en efectuar selección sanitaria en los viveros, de forma que sólo se multiplicaran plantas sanas. Además, se han efectuado con éxito, programas de erradicación en Aragón y Navarra y programas voluntarios de reducción de inóculo en la Comunidad Valenciana y en Murcia. La lucha contra el virus de la tristeza ha seguido básicamente tres vertientes que han sido complementarias en algunos casos: erradicación, cuarentena y/o control de la introducción de nuevas variedades y patrones, y puesta en marcha de programas de obtención de plantas certificadas libres de virus e injertadas sobre patrones tolerantes a la enfermedad.
Desde 1975 se ha realizado un enorme esfuerzo científico y económico tanto a nivel público como privado, para desarrollar estrategias que permitieran manejar el problema de la tristeza y posteriormente, el de la sharka, a nivel nacional. Así se comenzó un ambicioso "Programa de mejora varietal de cítricos" en 1975 con el objetivo de obtener plantas libres de virus, mediante microinjerto de ápices caulinares in vitro, de todas las variedades de interés para la citricultura española y entregar este material a los viveros expresamente autorizados para propagar cítricos (NAVARRO et al., 1975; NAVARRO, 1976). Además, se constituyó un banco de germoplasma de cítricos libres de virus.
En el Centro Regional de Investigación y Desarrollo Agrario de Levante (CRIDA O7) del Instituto Nacional de Investigaciones Agrarias (hoy día denominado Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias-IVIA), se seleccionaron variedades españolas que fueron saneadas y entregadas al sector por medio de los viveros. En 1983 se incluyó en el Programa la introducción de variedades extranjeras de posible interés para la citricultura española. Para la importación de las mismas el Ministerio de Agricultura creó una estación de Cuarentena de Cítricos basada en la exclusiva introducción de material vegetal mediante un sistema de cultivo de tejidos in vitro (NAVARRO et al., 1984). Este sistema permite introducir y sanear simultáneamente el material importado y por tanto, eliminar los riesgos de introducción accidental de nuevas enfermedades o de estirpes más agresivas que las ya presentes en España.
Otras estrategias que se desarrollaron paralelamente para luchar contra la tristeza de los cítricos y el virus de la sharka, consistieron en: la puesta a punto de métodos sensibles de diagnóstico rápido del virus que pudieran ser aplicados a gran escala, en la producción de anticuerpos monoclonales específicos de CTV y de PPV para lograr su detección fiable y en estudios epidemiológicos que permitieran conocer la incidencia real y la dispersión de ambas enfermedades en diversas zonas ecológicas. La puesta a punto de la técnica inmunoenzimática ELISA, revolucionó las posibilidades de diagnóstico rápido y fiable, permitiendo realizar miles de análisis en poco tiempo.
Los estudios epidemiológicos realizados desde 1981 para CTV y desde 1985 para PPV, proporcionaron datos básicos para la identificación y elaboración de medidas y recomendaciones con impacto reductor en la tasa de infección. Se establecieron modelos matemáticos predictivos de la dispersión de ambas enfermedades y se elaboraron detallados mapas de infección por CTV a nivel de término municipal en las principales zonas citrícolas españolas (CAMBRA et al., 1990 y 2000a; GOTTWALD et al., 1996) y por PPV a nivel de diferentes CC AA (GOTTWALD et al., 1995). El conocimiento de la incidencia real de las enfermedades, del porcentaje de árboles infectados y de su evolución, ha permitido emitir recomendaciones específicas a los agricultores.
Con estas normas, el agricultor tuvo más elementos para tomar decisiones relativas al momento de arranque de las viejas plantaciones y su sustitución por otras con material certificado e injertado sobre patrones tolerantes a tristeza, o con material libre de virus para el caso de la sharka. El cambio hacia una citricultura y fruticultura modernas, ha sido imparable y las estrategias utilizadas y las recomendaciones efectuadas han sido muy útiles para realizar el cambio. Las viejas plantaciones han sido progresiva y sistemáticamente reemplazadas, la tristeza y la sharka, han actuado de catalizadores. En la actualidad se han plantado más de 120 millones de plantones certificados injertados fundamentalmente en Citrange Carrizo o Troyer y con una creciente demanda sobre Citrus macrophylla. Ello implica que el 80% de la citricultura española y casi el 90% de la citricultura de la Comunidad Valenciana, están protegidas contra las razas del CTV presentes en la actualidad en España.
De forma similar, se han realizado numerosas plantaciones con material libre de PPV en extensas zonas, pudiéndose afirmar que ha habido un antes y un después, en la actitud de los productores con respecto a la importancia del material vegetal y a su calidad sanitaria en frutales de hueso. Actualmente España lidera la producción de cítricos de calidad y la producción de frutales de hueso de variedades precoces. Todo ello, sin duda es fruto del esfuerzo desarrollado por la iniciativa privada y pública, que ha luchado para superar los problemas plantados por la presencia de CTV y de PPV.
Métodos de detección de los virus, avances en el diagnóstico y toma de muestras
Los protocolos oficiales europeos de diagnóstico y detección del virus de la tristeza de los cítricos y del de la sharka de frutales de hueso, pueden ser consultados en la página web http://www.csl.gov.uk/science/organ/ph/diagpro. La detección y el diagnóstico de ambos virus se realizó durante años mediante pruebas biológicas consistentes en inocular limas mejicanas o melocotoneros de semilla, respectivamente, en condiciones controladas de invernadero. El método aún siendo sensible, era lento, caro y no permitía el análisis de gran cantidad de muestras.
La aplicación de la técnica serológica ELISA posibilitó la realización de gran número de muestras procedentes de prospecciones para conocer la incidencia, hizo posible el control en viveros y realizar estudios epidemiológicos para ayudar a tomar decisiones de mejora del control y lucha. A pesar de su gran sensibilidad y fiabilidad, la técnica ELISA clásica posee el inconveniente de precisar un laboratorio y técnicos especializados para su realización. Además la necesaria preparación de extractos complica su aplicación en el caso de plantas leñosas y reduce a unas 300 el número de muestras que pueden realizar diariamente un equipo de dos personas.
El desarrollo de la técnica de Inmunoimpresión-ELISA para detección de CTV (GARNSEY et al., 1993, CAMBRA et al., 1994b) y su disponibilidad y registro comercial mediante acuerdo IVIA y la empresa valenciana Plant Print Diagnòstics, S.L.(www.plantprint. net), ha permitido resolver de forma definitiva los problemas del diagnóstico del virus de la tristeza (CAMBRA et al., 2000b). El método es muy sencillo ya que no precisa realizar extractos. La muestras recolectadas en campo o invernadero son seccionadas con un elemento cortante y presionadas directamente sobre una membrana de nitrocelulosa. La huella o impronta que dejan las secciones de brotes jóvenes, pedicelos de hojas o pedúnculos de fruto, permiten la detección del virus de forma muy sensible, rápida (3 horas) y sencilla a personal no especializado y en condiciones de campo.
Desde 1994 se han realizado más de dos millones de análisis de plantas, muchas veces en las propias instalaciones de los viveros, independientemente de los controles oficiales de la producción viverística. Un equipo de dos personas es capaz de recolectar, imprimir y analizar 1.250 plantas de vivero o unos 500 árboles adultos por día, con un coste aproximado de 0.20 Euros por planta. Además, se han puesto a punto métodos moleculares para detección de CTV, para disponer de más herramientas a la hora de confirmar diagnósticos. Las repercusiones de los nuevos métodos de diagnóstico en la lucha y control de la sharka son muy claras. La disponibilidad de un estuche comercial de ELISA DASI con anticuerpos monoclonales 5B-IVIA ( CAMBRA et al., 1994a) (C.E. Durviz / Real; www.durviz.com), permite mantener la producción de plantas libres de PPV, la realización de numerosos controles y la erradicación selectiva de tipos agresivos del virus, ya que se dispone, incluso comercialmente, de una batería de anticuerpos monoclonales, sondas de hibridación molecular e iniciadores de PCR, específicos de cada tipo de PPV. Se puede afirmar que la disponibilidad de estos métodos fiables de detección de PPV, ha sido definitiva en el éxito de los extensivos programas de erradicación de PPV que se realizan en EE UU y en Canadá, donde se utilizan de forma masiva.
El diseño de sistemas de detección de alta sensibilidad no sería útil si no se determina el mejor tipo de muestra y el momento más adecuado para tomarla. Así, se han realizado estudios en cítricos y en frutales, tanto en plantas de vivero como en árboles de campo, para determinar la toma de muestras ideal. Las características de las mismas para detección de CTV y de PPV, están indicadas en la página web: www.csl.gov.uk/science/organ/ph/diagpro. Para el caso concreto de CTV-cítricos la toma de muestras ha sido estudiada por Cambra et al., (2003).
Conclusiones generales
El diseño de sistemas sensibles de detección y diagnóstico, unido a un meticuloso estudio de la toma de muestras, es esencial en plantas leñosas que permanecen durante mucho tiempo en el mismo terreno y que por tanto, están sujetas al permanente riesgo de la infección natural por vectores.
Las técnicas apropiadas por su especificidad y sensibilidad, aplicadas convenientemente a material vegetal o a vectores, pueden constituir una excelente herramienta para evaluar la incidencia de enfermedades y para proceder a su control.
Los datos emanados de estudios epidemiológicos, realizados con ayuda de estas técnicas fiables, han resultado de gran ayuda a los productores para tomar decisiones y luchar contra enfermedades graves causadas por virus.
Así en España, todo este conjunto de técnicas y recomendaciones surgidas de su aplicación , ha contribuido de manera definitiva para superar la amenaza que supuso la introducción y dispersión de los virus de la tristeza de los cítricos y del de la sharka de los frutales de hueso.
BIBLIOGRAFÍA
CAMBRA, M. ASENSIO, M., GORRIS, M.T., PÉREZ, E., CAMARASA, E., GARCÍA, J.A., LÓPEZ-MOYA, J.J., LÓPEZ-ABELLA, D., VELA, C., SANZ, A. 1994a. Detection of Plum pox potyvirus using monoclonal antibodies to structural and non-structural proteins. bulletin OEPP/EPPO Bulletin 24, 569-577.
CAMBRA, M., CAMARASA, E., GORRIS, M.T., ROMÁN, M.P., ASENSIO, M., PÉREZ E., SERRA, J. CAMBRA, M.A., 1994b. Detección de proteínas estructurales de virus mediante inmunoimpresión-ELISA y su uso en diagnóstico. Investigación Agraria. Fuera de Serie nº 2, 221-230.
CAMBRA, M., CRESPO, J., GORRIS, M. T., OLMOS, A., CAMBRA, M. 2003. Detección y erradicación del virus de la sharka tipo Marcus en Aragón. Vida Rural 165, 50-56.
CAMBRA, M., GORRIS, M.T., OLMOS, A., MARTÍNEZ, M.C., ROMÁN, M.P., BERTOLINI, A., LÓPEZ, A., CARBONELL, E.A., 2002. European Diagnostic Protocols (DIAGPRO) for citrus tristeza virus in adult trees. Proc. 15th Conf. Inter. Organ. Citrus Virol, IOCV. Riverside 69-77.
CAMBRA, M. GORRIS , M.T., ROMAN, M.P., TERRADA, E., GARNSEY, S.M., CAMARASA E., OLMOS, A., COLOMER, M., 2000b. Routine detection of citrus tristeza virus by direct immunoprinting-ELISA method using specific monoclonal and recombinant antibodies. Proc. 14th Conf. Inter. Organ. Citrus Virol, IOCV. Ed. J. V. da Graça, R.F.Lee, R.K. Yokomi. Riverside, pp 34-41.
CAMBRA, M., SERRA, J., BONET, J.C., VILLALBA, D., 1990. Situación de la tristeza de los cítricos en la Comunidad Valenciana, 32 pp. Generalidad Valenciana, Conselleria d?Agricultura i Pesca. Serie Fullets Divulgació nº 3-90, Valencia.
CAMBRA, M. GORRIS , M.T., MARROQUIN, C., ROMÁN, M.P., OLMOS, A. MARTÍNEZ, M.C. HERMOSO DE MENDOZA, A. LÓPEZ, A. NAVARRO, L., 2000a. Incidence and epidemiology of Citrus tristeza virus in the Valencian Community of Spain. Virus Research 71, 85-95.
GARNSEY, S.M., PERMAR, T.A., CAMBRA, M., HENDERSON, C.T., 1993. Direct tissue blot immunoassay (DTBIA) for detection of citrus tristeza virus (CTV). In: P. Moreno, J. Da Graça and L.W. Timmer (Eds), Proc. 12 th. Inter. Conf. Organ. Citrus Virol., IOCV. Riverside, pp. 39-50.
GOTTWALD, T.R., AVINENT, L., LLÁCER, G., HERMOSO DE MENDOZA, A., CAMBRA, M. 1995. Analysis of the spatial spread of sharka (plum pox virus) in apricot and peach orchards in eastern Spain. Plant Disease 79, 266-278.
GOTTWALD, T.R., CAMBRA, M., MORENO, P., CAMARASA, E., PIQUER, J., 1996. Spatial and temporal analyses of citrus tristeza virus in Eastern Spain. Phytopathology 86, 45-55.
LLÁCER, G. CAMBRA, M. 1986. Occurrence of plum pox virus in Spain in a new natural host: Prunus salicina Lindl. (Japanese plum). Plant Disease 70 (2). Disease note.
LLÁCER,G., CAMBRA, M., LAVIÑA, A. 1985. Detection of Plum pox virus in Spain. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 15, 325-329.
NAVARRO, L., 1976. The Citrus Variety Improvement Program in Spain. In: S., Calavan (Ed), Proc. 7 th. Inter. Conf. Organ. Citrus Virol., IOCV. Riverside, pp. 198-203.
NAVARRO, L., JUÁREZ, J., PINA, J.A., BALLESTER, J.F., 1984. The Citrus Quarantine Station in Spain. In: S.M. Garnsey, L.W. Timmer and J.A. Dodds (Eds), Proc. 9 th. Conf. Inter. Organ. Citrus Virol., IOCV. Riverside, pp365-370.
NAVARRO, L., ROISTACHER, C.N., MURASHIGE, T., 1975. Improvement of shoot-tip grafting in vitro for virus-free citrus. J. Amer. Soc. Hort. Sci. 100, 471-479. OEPP. 2004. First finding of Toxoptera citricida in mainland Portugal. NPPO of Portugal, 2004-09. EPPO Reporting Service 2004/130.
