INTRODUCCIÓN
En la actualidad la protección de cultivos se apoya principalmente en el uso de plaguicidas. Así, el gasto mundial en protección de cultivos corresponde en un 80% al uso de éstos. Las técnicas de transformación genética pueden tener un impacto importante en modificar este panorama disminuyendo el peso relativo de los plaguicidas en protección vegetal.
Desde que a finales de los años 80 aparecieron los primeros informes sobre plantas transgénicas resistentes a insectos (VAECK et al., 1987), se han producido avances espectaculares. En 1996 se comercializaron los primeros cultivos transgénicos, y la superficie mundial dedicada a estos cultivos ha ido aumentando progresivamente hasta alcanzar en 2003 un total de 67,7 millones de ha (JAMES, 2003).
Se espera que esta tendencia al alza se siga manteniendo en los próximos años y se prevé que para el 2010 su uso suponga un 20% del coste mundial en protección de cultivos. La obtención de plantas transgénicas que expresan proteínas insecticidas puede considerarse una estrategia de control análoga al uso de variedades resistentes, pero es una vía más rápida y flexible para llegar a cultivar plantas con altos niveles intrínsecos de resistencia a plagas. Inconvenientes ligados a la mejora de plantas tales como el escaso número de genes transferibles y el tiempo necesario para la expresión adecuada son actualmente superables mediante la utilización de técnicas de transformación genética de plantas.
La bacteria Bacillus thuringiensis ha sido la fuente por excelencia de toxinas específicas para el control de insectos, que expresadas a partir de transgenes en distintas plantas cultivadas han dado lugar a lo que se conoce genéricamente como plantas Bt. Hasta la fecha, las plantas transgénicas que expresan toxinas Bt (maíz, algodón y patata) han sido las únicas producidas comercialmente para el control de insectos. En España, la única planta transgénica aprobada para su cultivo y uso comercial es el maíz-Bt.
Su cultivo se inició en 1998 con la aprobación de la variedad Compa CB (toxina Cry1Ab, evento 176, Syngenta). La superficie cultivada en el periodo 1998-2002 se mantuvo en torno a las 22.000 hectáreas, lo que representa cerca del 5% de la superficie total de maíz. Con la aprobación de 11 nuevas variedades del evento MON810 y tres del evento 176 durante los años 2003 y 2004, la superficie en la campaña de 2004 ha aumentado hasta unas 58.000 ha.
El éxito comercial del maíz Bt puede atribuirse, en buena medida, al comportamiento y la biología de las dos especies diana, los taladros Sesamia nonagrioides (Lefèbvre) (Lepidoptera: Noctuidae) y Ostrinia nubilalis (Hübner) (Lepidoptera: Crambidae). Su comportamiento alimenticio les lleva a penetrar en el tallo de las plantas de maíz desde las primeras fases larvarias y a excavar largas galerías que pueden causar notables pérdidas de rendimiento. Este comportamiento limita notablemente las posibilidades de control biológico y químico.
Las cañas del maíz actúan como una barrera de protección dificultando la acción de los enemigos naturales (depredadores y parasitoides) potenciales así como de los insecticidas convencionales. Se ha postulado que el cultivo a gran escala del maíz Bt puede plantear diversos riesgos ecológicos. Uno de ellos, habitual en el control químico, es la posible aparición de líneas de taladros resistentes a la toxina Cry1Ab, expresada en el maíz Bt, debido a la exposición continuada a altos niveles de la misma.
Otro riesgo puede derivarse de su incorporación a la cadena trófica y su posible repercusión en la fauna no diana. La gran importancia económica, ecológica y social de estos riesgos hace, por tanto, necesario realizar investigaciones que aporten datos científicos a estos interrogantes.
Un aspecto fundamental para determinar la evolución de la resistencia de los taladros a la toxina Cry1Ab así como sus posibles efectos negativos en los depredadores presentes en el cultivo es disponer de métodos de muestreo fiables que permitan comparar resultados en distintos agroecosistemas.
Muestreo para el Seguimiento de la Resistencia
La detección precoz de insectos resistentes en poblaciones naturales es de enorme utilidad para diseñar estrategias que prevengan o retrasen la aparición de poblaciones resistentes, y prolonguen la vida útil de las variedades Bt. Además, es necesario contar con una metodología que permita discriminar entre las variaciones poblacionales naturales y la adquisición de resistencia moderada o baja, puesto que se han encontrado grandes diferencias en la susceptibilidad de poblaciones naturales de varias especies de insectos (TABASHNIK, 1994).
La aparición de resistencia puede detectarse directamente mostrando disminución en la susceptibilidad a la toxina de una determinada población a lo largo del tiempo. Para ello hay que valorar la susceptibilidad basal de diferentes poblaciones geográficas al Bt y después realizar un seguimiento sistemático en campo para detectar la resistencia cuando aparezca. La susceptibilidad basal a la toxina Cry1Ab de S. nonagrioides y O. nubilalis se estableció en España en 1998 (GONZÁLEZ-NUÑEZ et al., 2000).
A partir de entonces, se han realizado muestreos anuales de las dos especies de taladros en campos de maíz Bt en áreas representativas del cultivo (Figura 1), con objeto de comparar su susceptibilidad a la toxina Bt en relación al nivel basal de susceptibilidad establecido a partir de campos de maíz no Bt. El seguimiento de la evolución de la resistencia se ha realizado de acuerdo con el protocolo propuesto por el grupo de expertos de la Unión Europea.
El método de muestreo consiste en recoger anualmente entre 300 - 500 larvas en dos o tres campos distintos de maíz Bt en cuatro zonas maiceras representativas. En el momento de la recogida todas las larvas se encuentran diapausadas o bien se les induce la diapausa en el laboratorio para sincronizar su ciclo biológico y para facilitar su manejo.
Con objeto de prevenir la contaminación por microorganismos entomopatógenos, las larvas recogidas en campo se sumergen en una solución de 0,01% de nitrato de fenilmercurio. Cuando era necesario romper la diapausa, se ponían en condiciones de 28ºC y luz continua para obtener pupas, que se sexaban y se disponían en ponederos donde emergían los adultos.
En el caso de S. nonagrioides se montaban para cada población 20 ponederos con 7-10 parejas cada uno de ellos, mientras que para O. nubilalis se utilizaban 4-5 ponederos con 50 parejas cada uno. Los bioensayos para determinar los cambios en susceptibilidad en ambas especies de taladros se han realizado con larvas neonatas descendientes de las recogidas en campo de acuerdo con el protocolo establecido.
La dieta semisintética usada para la cría de cada especie se dispensa en bandejas de ensayo con 128 celdas (1 ml/celda) y se trata en superficie con la toxina Cry1Ab utilizando entre 7 y 9 concentraciones. Sobre cada celda se deposita una larva neonata (<24 h) que se confina con una película de plástico adherente. Para cada dosis se utiliza un total de 3 repeticiones de 16 larvas tomadas al azar de cada una de las jaulas de oviposición, para garantizar la máxima variabilidad de las poblaciones recogidas.
Las bandejas se incuban a 25 ± 0,3ºC, 70 ± 5 % r.h., y oscuridad constante, evaluándose a los 7 días la mortalidad larvaria. Para cada población, los datos de mortalidad permiten determinar la susceptibilidad a la toxina Cry1Ab (CL50 con un nivel de confianza del 95%) mediante la realización de un análisis probit con el programa POLO-PC (LeOra Software, 1987).
Las diferencias en susceptibilidad se comparan mediante la razón de las concentraciones letales a la CL50 (ROBERTSON Y PREISLER, 1992). Hasta la fecha no se ha obtenido un aumento significativo de la tolerancia de O. nubilalis o S. nonagrioides a la toxina Cry1Ab en ninguna de las zonas muestreadas (FARINÓS et al., 2004), aunque se han observado variaciones entre años en algunas de las zonas.
Tampoco se ha documentado la génesis de resistencia al maíz Bt en O. nubilalis en Estados Unidos, donde la comercialización del maíz data de 1996. Otro aspecto muy importante para un correcto manejo de la resistencia es la estimación de la frecuencia de alelos de resistencia en las poblaciones de campo. Recientemente, hemos iniciado estudios para determinar dicha frecuencia en poblaciones españolas de S. nonagrioides mediante la técnica denominada "F2 screen" (ANDOW y ALSTAD, 1998). Por este procedimiento se pueden estimar las frecuencias de los alelos de resistencia de una población, exponiendo la generación F2 descendiente de parentales capturados en campo a una dosis discriminante de toxina. Aumentos en la frecuencia de alelos resistentes implican una disminución de la susceptibilidad de la población.
Muestreo de los depredadores en el maíz Bt
Una de las primeras razones para el desarrollo de plantas transgénicas resistentes a plagas, enfermedades y malas hierbas es reducir la dependencia actual de plaguicidas convencionales, lo que conlleva una reducción de las aplicaciones insecticidas y un menor riesgo ambiental. La toxina Cry1Ab que expresa el maíz Bt tiene una actividad insecticida específica contra los taladros del maíz. No obstante, existen estudios de laboratorio (HILBECK et al., 1998) en los que se sugiere que existe un riesgo potencial de que pueda afectar a los enemigos naturales presentes en el cultivo.
Por otro lado, Saxena et al. (1999) demostraron que las toxinas Cry expresadas en el maíz Bt pueden pasar al suelo a través de exudados de las raíces. Este efecto negativo podría ser particularmente relevante para los depredadores del suelo. Es muy importante conocer la diversidad y abundancia de los depredadores presentes en el cultivo puesto que son agentes básicos en la regulación de las poblaciones de insectos plaga. Los estudios de campo realizados no han revelado efectos negativos del maíz Bt en la abundancia y diversidad de depredadores en el cultivo (ORR y LANDIS, 1997; JASINSKI et al., 2003; LOZZIA, 1999; WOLD et al., 2001). Sin embargo, la mayor parte de estos estudios fueron realizados a pequeña escala o sólo durante una campaña.
Se necesitan experimentos a escala comercial y realizados en mayor plazo de tiempo para evaluar la compatibilidad del maíz Bt con los enemigos naturales presentes en el cultivo (CANNON, 2000). En este contexto, en el año 2000 iniciamos estudios para evaluar el posible impacto de la toxina Cry1Ab sobre la abundancia y diversidad de artrópodos depredadores (fauna auxiliar) que coinciden espacial y temporalmente con el cultivo del maíz Bt. El ensayo se realizó en un campo comercial en Madrid. Se establecieron tres tratamientos: maíz Bt (cv Compa CB), y el cv isogénico Dracma con y sin Imidacloprid (Gaucho), en parcelas comerciales (ª 0,6 ha) con tres repeticiones dispuestas en bloques al azar.
Se utilizaron dos métodos distintos de muestreo: conteo visual para estudiar los depredadores presentes en la planta y trampas de gravedad para estudiar los depredadores terrestres. El conteo visual es un método de muestreo absoluto para cuantificar la fauna presente sobre la planta y aporta gran precisión, aunque tiene el inconveniente de requerir más tiempo que otros métodos como la aspiración con D-vac, el golpeo o el barrido de la vegetación (MICHELS, 1992; AMALIN et al., 2001).
Las trampas de gravedad se consideran un método apropiado para muestrear artrópodos terrestres, y son especialmente útiles para estudiar carábidos y arañas del suelo (LUFF, 1975; NIEMELÄ et al., 1986). El número de artrópodos capturados depende tanto del tamaño de su población como de su actividad que, a su vez, está determinada por factores del hábitat, como la temperatura, que mantiene una correlación directa con la movilidad de los artrópodos.
Otros factores que influyen en el número de capturas son la estructura del suelo (GREENSLADE, 1964) y la forma, tamaño, material o incluso el líquido conservante, que puede actuar como repelente o atrayente (LUFF, 1975; ADIS, 1979). Sin embargo, las trampas de gravedad son útiles para establecer diferencias en la abundancia y diversidad de comunidades entre distintas situaciones con una estructura de hábitat similar (MELBOURNE, 1999).
En el muestreo visual, se contabilizaron todos los artrópodos encontrados en la planta de maíz cada quince días entre mediados de junio y mediados de septiembre. Para ello, se tomaba una de las dos diagonales de cada parcela y se escogían 16 plantas al azar separadas por distancias constantes según el tamaño de la parcela. Se dejó un margen mínimo sin muestrear de 6,5 m en el perímetro de la parcela, para evitar el efecto borde.
En cada planta se observaban detalladamente las hojas, el tallo, la inflorescencia masculina y las espatas que recubren la mazorca y se registraban todos los artrópodos (fitófagos y depredadores) y su estado de desarrollo (adultos, pupas, ninfas o larvas) encontrados sobre cada planta. Las trampas de gravedad se dispusieron, a distancias constantes, en número de 5 por parcela (45 trampas en total) siguiendo la diagonal principal. Al igual que en el muestreo visual, se dejó un margen mínimo de 6,5 m en el perímetro de la parcela sin trampas, para evitar el efecto borde.
Las trampas consistían en un vaso de plástico de 12 cm de altura y 12,5 cm de diámetro que iba enterrado a ras de suelo. Dentro de este vaso se introducía un tarro de plástico de 5,7 cm de altura y 5,5 cm de diámetro que contenía agua y etanol al 96% en proporción 1:1 con el fin de que los artrópodos se conservaran mejor y se hundieran con más facilidad, al romper el alcohol la tensión superficial del agua. Cubriendo el tarro se situaba un embudo de 12 cm de diámetro, también de plástico, al que se le había cortado el vástago, de forma que encajaba con el vaso.
Muestreo visual
Durante los años 2000 y 2001, los depredadores más abundantes (75% y 85% del total, respectivamente) encontrados sobre las plantas de maíz fueron varias especies de arañas (Araneae) y dos especies de Orius: O. majusculus y O. laevigatus (Heteroptera: Anthocoridae), siendo mayoritaria la primera. Sin embargo, durante 2002 el depredador más abundante fue Stethorus punctillum (Coleoptera: Coccinellidae) que alcanzó una abundancia relativa del 45% (Figura 2) debido a altos niveles de infestación de araña roja. Otros depredadores encontrados en los muestreos fueron larvas de Chrysoperla carnea (Neuroptera: Chrysopidae), adultos de Coccinella septempunctata y Adonia variegata (Coleoptera: Coccinellidae), Nabis sp. (Heteroptera: Nabidae), adultos de estafilínidos (Coleoptera: Staphylinidae), larvas de Feltiella acarisuga (Diptera: Cecidomyiidae) y larvas de Episyrphus balteatus (Diptera: Syrphidae).
Trampas de gravedad
La Figura 3 representa de forma gráfica los depredadores más abundantes (en porcentaje) capturados en las trampas de gravedad durante los tres años de estudio. Arañas y carábidos (Coleoptera: Carabidae) fueron los depredadores más abundantes durante los tres años, seguidos de los estafilínidos y otras familias como Labiduridae (Dermaptera), nábidos, Phalangiidae (Opiliones) y Lithobiidae (Chilopoda) en menor cantidad, todos ellos depredadores generalistas. Los dos grupos más importantes (carábidos y arañas) suponen más del 80% de los depredadores capturados en los tres años de estudio. Hasta la fecha, los ensayos de campo iniciados en 2000 en parcelas comerciales de maíz Bt no han mostrado una disminución en la diversidad y abundancia de las especies mayoritarias de enemigos naturales presentes en el cultivo del maíz en España. No obstante, es necesario disponer de un mayor número de datos, obtenidos en distintos agroecosistemas y con una metodología semejante, para hacer una valoración más precisa de los potenciales efectos secundarios del maíz Bt. En esta evaluación no se debe considerar sólo el riesgo del cultivo de la variedad transgénica sino el relativo a las alternativas de control asociadas a no cultivarlas, lo que significa un mayor uso de insecticidas.
Conclusiones
De los resultados obtenidos en el presente estudio pueden extraerse las siguientes conclusiones: a) no se observan cambios en la susceptibilidad de las poblaciones de taladro a la toxina Bt después de 6 años de cultivo del maíz-Bt en España; b) no se detectan cambios en la composición y abundancia de los depredadores presentes en campos comerciales de maíz Bt; y c) es aconsejable continuar el programa de seguimiento y su implementación a nivel europeo para obtener datos sobre las implicaciones ambientales del cultivo comercial del maíz Bt a medio y largo plazo.
Agradecimientos: Este trabajo se ha realizado dentro de un Convenio de Colaboración entre el CSIC y el Ministerio de Medio Ambiente.
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