Se ensayó el efecto de varias concentraciones de ácido acetil salicílico (AAS) y de 4-acetamidofenol (4-AMP) para verificar su efectividad sobre el crecimiento miceliar in vitro del hongo Ophiostoma novo-ulmi Brasier. Se realizaron para cada producto y concentración (0, 250, 350, 450, 550, 650, 750 y 850 ppm) un total de treinta réplicas. O. novo-ulmi resultó ser ligeramente más sensible al 4-AMP que al AAS y las colonias presentaron diferencias morfológicas y de color. La DL50 para AAS fue de 510 ppm y la del 4-AMP de 454 ppm.
Por otra parte se ensayó la eficiencia in vivo del AAS inoculando ramillas sanas de olmo (Ulmus minor Mill.) con O. novo-ulmi las cuales se trataron con las mismas concentraciones utilizadas en las pruebas in vitro. A los 6 dias de la inoculación, a 25ºC, la densidad de sinemas decrecia gradualmente a medida que aumentaba la concentración de AAS y a los 750 ppm prácticamente ya no se desarrollaban dichas estructuras reproductoras.
INTRODUCCIÓN
Ophiostoma novo-ulmi (Buisman) C. Moreau es el hongo responsable de la grafiosis del olmo conocida también como enfermedad holandesa del olmo, la más grave de todas las que afectan dicha especie (BECKMAN y col., 1981). Dada la dificultad del control químico de O. novo-ulmi (GIL, 1990, SCHREIBER y GREGORY, 1981) el objetivo de este estudio es ensayar el efecto de varias concentraciones de ácido acetil salicílico (AAS) y 4-acetamidofenol (4-AMP) sobre el crecimiento miceliar in vitro de un aislamiento agresivo y determinar la DL50 de estos productos.
Para verificar la eficacia del AAS en condiciones in vivo se inocularon ramillas de olmo con la misma cepa de O. novo- ulmi y posteriormente se trataron con las mismas concentraciones utilizadas en el ensayo in vitro. O. novo-ulmi se aisló a partir de una rama de olmo (Ulmus minor Mill.) de la ciudad de Barcelona infectado espontáneamente por la cepa agresiva NAN (MUÑOZ, 1985). El olmo presentaba marchitez del follaje, oscurecimiento de los vasos internos y ápices de las ramillas curvadas (GIL y col., 2000; MORET y col., 1995).
Material y métodos
Ensayo de la actividad fungicida in vitro del AAS y del 4- AMP sobre el crecimiento miceliar
La cepa de O. novo-ulmi utilizada en los ensayos se mantenía en la micoteca de la Unidad de Fitopatología de la Facultad de Biología de la Universidad de Barcelona desde 1994. Las diluciones del AAS y del 4-AMP se prepararon diluyendo 500 mg de cada una de estas sustancias en 30 ml de alcohol etílico absoluto y 20 ml de agua destilada estèril; el pH se ajustaba a 7 con KOH al 4%. El medio de cultivo (patata-dextrosa-agar, PDA) conteniendo 0 (control), 250, 350, 450, 550, 650, 750 y 850 ppm de una u otra de las dos sustancias, se distribuyó en cápsulas de Petri (90 mm de diámetro); ambos productos se añadían al medio a 60ºC después de autoclavarlo durante 20 minutos a 120ºC.
A continuación en el centro de cada cápsula (15 ml de medio de cultivo) se colocó un cilindro de 5 mm de diámetro procedente de un cultivo del hongo en crecimiento activo de dos semanas. Las cápsulas se incubaron 10 días en la oscuridad a 25ºC y su crecimiento se controlaba diariamente. Se realizaron un total de 30 réplicas de cada concentración y producto. El crecimiento miceliar se calculó a partir de la media de tres diámetros trazados en cada cápsula y los datos obtenidos se utilizaron para determinar la DL50 del AAS y del 4-AMP.
Evaluación de la eficacia de las concentraciones del AAS ensayadas in vitro sobre ramillas de olmo inoculadas con O. novo-ulmi.
Para verificar la eficacia del AAS, se usaron cilindros de ramillas de 5 cm de longitud y 1 cm de diámetro de un olmo sano (U. minor) procedente de Barcelona. Estos cilindros se esterilizaron superficialmente durante 2 minutos con hipoclorito sódico al 5% y posteriomente se lavaron dos veces con H2O estéril durante 5 minutos. Después de secarlos se inocularon artificialmente con O. novo-ulmi y se mantuvieron durante 48 horas en cámara oscura a 25ºC.
En la Fotografía 1 se puede observar que el paquete de ramillas se inoculaba disponiéndolo encima de un cultivo de O. novo-ulmi de modo que una de sus secciones permanecía en contacto con el estrato miceliar. Se preparó también un control negativo (no inoculado) disponiendo el paquete de ramillas directamente sobre PDA de una cápsula estéril y un control positivo (inoculado pero no tratado con AAS). Después de la incubación, las ramillas se esterilizaron superficialmente de nuevo y se introdujeron en tubos de ensayo que contenían solución mineral nutritiva (solución de Knob) con las mismas concentraciones usadas en los ensayos in vitro.
En este caso, la dilución del AAS se preparó con etanol y se substituyó el agua por solución de Knob. Se prepararon dos controles: un control positivo (ramillas inoculadas en 2.5 ml de solución nutritiva y 150 ?l de etanol absoluto) y un control con eosina (ramillas inoculadas en 2.5 ml de solución nutritiva y 150 ?l de eosina al 1% para asegurarnos de la absorción del producto).
El material inoculado se incubó durante 6 días a 24ºC; a continuación se esterilizó superficialmente cada ramilla y éstas se dispusieron individualmente en cámara húmeda en la cual se mantuvieron durante 7 días a oscuras a la misma temperatura de incubación. Finalmente se procedió al contaje bajo la lupa binocular de los sinemas que se habían desarrollado en la sección transversal de la parte inoculada del las ramillas. Se prepararon dos réplicas de cada concentración.
Resultados
Ensayo de la actividad del AAS y del 4-AMPsobre el crecimiento miceliar de O. novo-ulmi y determinación de la DL50 de los dos productos.
De los dos productos ensayados bajo condiciones in vitro, se observó que O. novo- ulmi era ligeramente más sensible al 4-AMP que al AAS (Fotografía 2). En la Tabla 1 se indican los diámetros de las colonias en mm a los 10 días de crecimiento del hongo y en las Figuras 1 y 2 se representan respectivamente las rectas de regresión del AAS y del 4-AMP. La ecuación de la recta de regresión para el AAS es Y = 1026,1-16,37X, con una r2 de 0.95, mientras que para el 4-AMP es Y = 905,714-14,24X, con una r2 de 0.99.
A partir de estas rectas se calcularon las DL50 siendo para el AAS de 510 ppm y para el 4-AMP de 454 ppm. En los tratamientos con AAS no se observaron cambios de coloración ni morfológicos de las colonias respecto las cápsulas control. Sin embargo, en los ensayos con 4-AMP se producía un cambio significativo tanto de la forma como del color de las colonias.
Las colonias que se desarrollaban en PDA con 4-AMP adquirían un color marrón-rosado, aspecto algodonoso en determinadas áreas y eran claramente zonadas. La intensidad de la coloración era directamente proporcional al incremento de concentración del producto; así, las cápsulas con mayores concentraciones de 4-AMP se oscurecían mucho más rapidamente que las que contenían bajas concentraciones del producto pero al cabo de diez días de incubación, todas ellas tomaban un color marrón oscuro. Las colonias control y las tratadas con AAS eran lisas y mantenían el color amarillento indefinidamente.
Evaluación de la eficacia de las concentraciones de AAS en las ramillas de olmo inoculadas con O. novo-ulmi.
El número de sinemas que se formaron sobre las ramillas tratadas en la solución nutritiva con AAS decrecía gradualmente a medida que la concentración aumentaba aunque en ningún caso se inhibieron totalmente. También se observó que la disminución de la formación de sinemas iba acompañada de un incremento de desarrollo miceliar en la fase de Sporothrix. Las ramillas sumergidas en 0, 250 y 350 ppm de AAS no desarrollaron micelio visible y formaron sinemas básicamente en los ápices; no obstante, a concentraciones de 450, 550 y 650 ppm la abundancia de micelio en las secciones se incrementaba proporcionalmente a la cantidad de AAS y el número de sinemas decrecía.
En la Figura 3 se observa el escaso desarrollo de sinemas a 750 y 850 ppm. Los vasos de las ramillas submergidas en eosina adquirieron un color rojizo lo cual nos permitió constatar la absorción del producto a través del xilema.
Conclusiones
De los resultados obtenidos in vitro se deduce que el 4-acetamidofenol y el ácido salicílico inhiben eficientemente el desarrollo de O novo-ulmi, sin embargo, el 4-AMP actua con mayor eficacia que el AAS tal como se deduce de los valores de las DL50.
El 4-acetamidofenol induce la formación de pigmentos y cambios morfológicos en el hongo aunque la intensidad de la coloración es directamente proporcional al incremento de la concentración del producto. En las experiencias in vivo se concluye que el AAS es efectivo para el control de O. novo-ulmi ya que reduce notablemente su crecimiento vegetativo y la formación de sinemas se inhibe fuertemente a partir de 750 ppm.
La inhibición del desarrollo de sinemas implica una menor dispersión de la enfermedad ya que disminuye la probabilidad de fijación de los conidios a los escolítidos vectores. Por estos motivos consideramos que ambos productos deberían ensayarse en condiciones de campo ya que constituyen una alternativa viable y económica para el control de la grafiosis del olmo.
BIBLIOGRAFÍA
BECKMAN, C.H., BRASIER A.M. et al. 1981. Compendium of elm diseases. APS. St. Paul, Minnesota
GIL, L. 1990. Los olmos y la grafiosis en España. Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación. Madrid
GIL, L., SOLLA, A., IGLESIAS, S. 2000. Los olmos ibéricos. Conservación y mejora frente a la grafiosis Ministerio de Medio Ambiente, Madrid.
MORET, A., NADAL, M., PARDO, G. A. 1995. Determinación de la agresividad de las cepas de Ceratocystis ulmi en Catalunya. Resúmenes de XI Simposio Nacional de Botánica Criptogámica, Santiago de Compostela, pp. 151-152.
MUÑOZ LÓPEZ, C. 1985. La grafiosis del olmo en España. Nuevos aislamientos de la cepa agresiva. Boletín de la Estación Central de Ecologia. Ministerio de Agricultura Pesca y Alimentación. Madrid. Año XIV. N. 27.
SCHREIBER, L.R., GREGORY, G.F. 1981. Growth of Ceratocystis ulmi on low concentrations of hydrochloride and phosphate salts of methyl 2-benzimidazole-carbamate and on thiabendazole hypophosphite. Phytopathology 71:1261-63
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