Aunque han aparecido nuevas técnicas analíticas para la determinación de las especies fúngicas, una herramienta importante y tradicional para el control micológico es el uso de métodos simples de identificación especifica que se realiza en base al aspecto de las colonias y la micromorfología en varios medios de cultivo a distintas temperaturas de incubación. El objetivo de este estudio fue caracterizar morfológicamente y culturalmente al hongo Fusarium culmorum aislado a partir de muestras de arroz con un periodo de almacenamiento de nueve meses. Para ello, se procedió a utilizar cuatro medios comunes: PDA, MEA, Cz y PSA en los que se sembró la especie en uno y tres puntos respectivamente y se incubó durante 5 días a 25ºC por ser esta la temperatura óptima descrita por varios autores. Para el estudio de las características microscópicas se utilizó la técnica del microcultivo.
INTRODUCCIÓN
De los genitivos plurales latinos fusus-i (huso, por la forma de las esporas) y culmus-i (caña) Fusarium sp. comprende una gran diversidad de hongos que están distribuidos por todo el mundo como oportunistas, saprofitos de restos vegetales e importantes patógenos de una gran variedad de plantas de diversas condiciones medioambientales (DOOHAN y col., 2003; LOGRIECO y col., 2003).
Las clamidosporas son ovales o globosas, intercalares o terminales con paredes lisas o rugosas, formadas individualmente en cadenas o en racimos. Además se caracteriza por secretar una sustancia hidrófila en cultivos viejos de 2 ó 3 semanas y por la germinación de los macroconidios para producir microconidios aberrantes en fiálides pequeñas.
Los macroconidios constituyen una importante fuente de inoculo y se convierten en el suelo en clamidosporas donde pueden sobrevivir durante muchos años para posteriormente germinar infectando las raíces de las plantas (SITTON y col., 1981).
Es de todas las especies del género Fusarium el único que compite bien con las especies de Aspergillus y Penicillium (LACEY, 1989). Fusarium culmorum, es considerado como un hongo de campo ya que requiere un alto contenido de humedad en el substrato para su crecimiento y la síntesis de micotoxinas (> 20 %) pero ocasionalmente se desarrolla en almacén cuando las condiciones le son favorables, es decir, a bajas temperaturas y alta humedad o si el grano ha sido secado insuficientemente y de forma rápida (LACEY Y MAGAN, 1991; CARUSO y col., 1999; LOGRIECO y col., 2003; HOPE y col., 2003).
Con independencia de su origen geográfico sus condiciones óptimas de crecimiento son: una temperatura de 25ºC, una actividad de agua de 0.99 o con un intervalo comprendido entre -8 a -14 bars y un pH bajo. (COOK Y CHRISTEN, 1976; LACEY Y MAGAN, 1991; PARRY y col., 1994; BRENNAN y col., 2003). Por otra parte es una especie muy tolerante a las bajas tensiones de O2 y presenta una alta resistencia a la radiación (MAGAN Y LACEY, 1984b; O?NEILL y col., 1991).
Fusarium culmorum es un importante patógeno de un amplia variedad de plantas, especialmente de cereales, reduciendo la germinación de las semillas, causando enfermedades en la plántulas, la podredumbre del pie y la raíz y la fusariosis o scab (HESTBERG y col., 2002; MIEDANER y col., 2004). La fusariosis fue considerada durante muchos años como una enfermedad de importancia secundaria pero debido a su severidad, el aumento de su frecuencia de aparición, el impacto que tiene sobre el rendimiento y la calidad del grano y la contaminación de este por micotoxinas, actualmente es una de las más importantes enfermedades fúngicas (BAI y col., 1996; LIGGITT y col.,1997; DOOHAN y col.,1999; VISCONTI y col., 2000; YI y col., 2001).
Es una enfermedad compleja y de infección floral llegando a ser asociada con ella hasta 17 especies fúngicas. Ha sido descrita en todo el mundo siendo F. culmorum predominante en las zonas frías del noroeste de Europa, Canadá y norte de Estados Unidos (PARRY y col., 1995; PIRGOZLIEV y col., 2003; TAN y col., 2003). Por otra parte, algunos de los agentes de biocontrol descritos para este hongo han sido: Gliocadium sp., Clonostachis rosea y Phythium sp. (TEPERI y col., 1998; DAVANLOU y col., 1999; JENSEN y col.,2000). Fusarium culmorum exhibe una gran diversidad molecular y fenotípica. Agresividad, perfiles y concentraciones de micotoxinas varían entre aislados (MIEDANER y col., 1996a; GANG y col., 1998; MUTHOMi y col., 2000).
La principales micotoxinas que produce son: Zearalenona (ZEA), Deoxinivalenol (DON), Nivalenol (NIV), Fusarenona-X (FUS), zearalenol (á y á isomeros) (ZoH) y monoacetildeoxinivalenol (3-AcDON, 15-AcDON) (ac-DON) (LOGRIECO y col., 2003) (Figura 1). La Zearalenona también llamada toxina F-2, es una lactona derivada del ácido resorcílico. Es un contaminante natural de la mayoría de cereales como trigo, maíz, cebada, sorgo, etc., ya sea en campo o en almacén. Pero también se ha encontrado en otros alimentos (CHEKOWSKI y col., 1983; TANAKA y col.,1985; UENO,1985; GONZÁLEz y col., 1999; SILVA y col., 2001). Se caracteriza por ser débilmente fitotóxica y producir hiperestrogenismo y problemas reproductivos en el ganado y animales de experimentación (DESJARDINS y col., 2001).
El nivel máximo admisible oscila entre 30 y 1000 ?g/Kg de cereales, legumbres y nueces según los países (SANCHIS y col.,2000). DON, NIV y FUS son tricotecenos de tipo B que poseen una función carbonilo en el carbono 8. Los tricotecenos son ésteres de alcoholes sesquiterpénicos que contienen un sistema característico de anillo tricíclico junto con el grupo 12,13-epóxido. DON produce diarrea, nauseas, vómitos, cefalalgia, dolor abdominal, anorexia, escalofríos, convulsiones, vértigo; y tiene efectos sobre el sistema inmunitario de los humanos, y en animales produce rechazo del alimento, vómitos e inmunosupresión (TERAO y col., 1991; BULLERMAN, 1997).
Materiales y métodos
Aislamiento de la especie
La especie que se ha utilizado en este trabajo, fue aislada en el laboratorio de Biología Vegetal de la Escuela Técnica Superior del Medio Rural y Enología de muestras de granos de arroz con un periodo de almacenamiento de 9 meses.
La empresa suministradora fue COPSEMAR. Para ello se preparó Agar Patata Dextrosa al que se añadió clorafenicol a razón de 0,5 g/l para evitar el crecimiento de levaduras y bacterias. En una gasa previamente esterilizada se colocaron 50 granos que fueron sumergidos en una solución de hipoclorito sódico al 2% durante 3 minutos y después se hicieron dos enjuagues sucesivos de la misma duración con agua destilada estéril.
Posteriormente, se colocaron asépticamente 5 granos por placa y se incubó durante 5 días a 25ºC en oscuridad (Figura 2). Finalmente, se procedió a separar las diferentes colonias de las especies fúngicas.
Crecimiento in vitro de la especie
Se observaron los mohos crecidos en cuatro medios comunes: Agar Patata Dextrosa (PDA), Agar Extracto de Malta (MEA), Agar Czapek-Dox (Cz) y Agar de Dextrosa Sabouraud (ADS). La siembra se hizo en uno y tres puntos equidistantes con placa invertida, y se incubaron a 25ºC durante cinco días.
Para la caracterización microscópica y debido a que la manera de formarse las esporas y las características de la célula conidiógena son fundamentales para la identificación de los fusarios, fue necesario emplear la técnica del microcultivo (STEIFERT, 2000). Para ello se depositó un cuadrado de 1 cm de lado de los distintos medios empleados sobre un portaobjetos. Se sembró el hongo en los bordes y se colocó el cubreobjetos. El conjunto se apoyó sobre una varilla de vidrio dentro de una placa Petri en cuyo fondo se había depositado papel de filtro embebido en agua. Todo el material utilizado fue esterilizado previamente y el montaje se realizó en condiciones asépticas.
Determinación de caracteres morfológicos y culturales
En cada una de las placas se observaron los siguientes caracteres:
Caracteres morfológicos:
1. Características de las hifas sumergidas: color, presencia o ausencia de septos, diámetro aproximado y caracteres distintivos de estructuras especiales si tienen.
2. Grado de desarrollo de las estructuras de fructificación.
3. Características y disposición de los órganos de fructificación maduros, libres o bien en el substrato, en la superficie o en el micelio aéreo. También es muy importante destacar si existe más de un tipo de estructura de esporulación.
4. Color, tamaño y forma de los órganos de fructificación, tomando medidas de las partes esenciales y disposición en ellas de esporas.
5. Detalles sobre la estructura de fructificación, tomando medidas de las partes fundamentales y disposición en ellas de las esporas.
6. Detalles completos de las esporas: color, forma, tamaño, tabicación y marcas superficiales.
Caracteres culturales:
1. Grado de crecimiento. Se describe como muy lento, lento, moderado, discreto, rápido, etc. En algunas diagnosis se dan los diámetros reales de las colonias transcurrido un determinado número de días.
2. Color de la colonia y cambios que pueda sufrir. Si es uniforme, por zonas o en mosaico. Es interesante anotar también los colores que aparecen alrededor de las colonias en desarrollo.
3. Colores y cambios que puedan producirse en el reverso de las colonias.
4. Cambios de color en el medio, tanto si tienen lugar sólo en el área de la colonia o si se ha difundido a este.
5. Textura superficial, ya sea suelta o compacta, plana, rugosa o curvada, aterciopelada, algodonosa, filamentosa, gelatinosa, etc.
6. Olor si existe. En general son muy difíciles de describir. Muchas especies tienen un olor que podríamos catalogar como "enmohecido".
7. Características del exudado del líquido transpirante, que se encuentra, a veces, en el crecimiento aéreo Las principales monografías que se han utilizado para la clasificación del género Fusarium son: Booth (1977); Gerlach y Niremberg, (1982); Nelson y col. (1983); Burgess y col. (1988); Pitt y Hocking (1999); Samson y col. (2000).
Resultados y discusión
En PDA a 25ºC las colonias presentan un diámetro de 7.5 a 9 cm en 4 días siendo donde se presenta un mayor crecimiento. El micelio aéreo es algodonoso, al principio su color va de blanco a amarillo o rosa, volviéndose ocre o marrón rojizo y fieltroso cuando se hace viejo.
El reverso y la superficie del agar, adoptan una coloración roja-púrpura o marrón (Figura 3). En ADS el crecimiento es muy similar al que se produce en PDA aunque un poco menos vigoroso y de una tonalidad más intensa. Las colonias en MEA presentan un diámetro de 4 a 5 cm, en 4 días, de aspecto aterciopelado. De color rojo claro hasta rojo pastel, comúnmente con una capa naranja grisácea hasta marrón amarillenta; reverso marrón a marrón rojizo (Figura 3).
Las colonias crecidas en Agar Czapek, alcanzan un diámetro de 5 y 6 cm a los cuatro días de crecimiento. El micelio aéreo es menos algodonoso que en PDA, el color del mismo varía desde entre blanco y amarillo, convirtiéndose con el tiempo en un naranja pálido. El reverso toma una coloración amarillo intenso o rosa (Figura 3)
Los macroconidios normalmente tienen 5 septos (aunque podemos encontrar de 3, 4, 6, 7 y 8 septos); 3 septos: 26-36 x 4-6 ?m; 4 septos: 30-46 x 5-7 ?m; 5 septos: 34-50 x 5-7 ?m. Clamidosporas: 10-14 x9-12?m (Figura 4).
BIBLIOGRAFÍA
BAI, G.; SHANER G. (1996) Variation in Fusarium graminearum and cultivar resistance to wheat scab. Plant Disease 80: 975?979.
BOOTH, C. (1977) The genus Fusarium. Commonwealth Mycological Institute. Kew, Surrey, U.K.
BRENNAN, J.M; FAGAN, B; VAN MAANEN A.;COOKE B.M. AND DOOHAN F.M. (2003) Studies on in vitro growth and pathogenicity of European Fusarium fungi European Journal of Plant Pathology 109: 577?587.
BULLERMAN, L.B. (1997) Fusaria and toxigenig molds and other Aspergilli and Penicillia. pp. 419-439 en: Doyle MP, Beuchat J.R, Motville TJ eds. Food Microbiology: Fundamentals and Frontiers. ASM Press, Washington.
BURGESS, L.W.; LIDDELL, C.M.; SUMMERELL, B.A. (1988) Laboratory manual for Fusarium research. 2nd Edition. The University of Sydney, Sydney.
CARUSO, C.; CHILOSI, G.; CAPORALE, C.; LEONARDI, L.; BERTINI, L.; MAGRO, P.; BUONOCORE, V. (1999) Induction of pathogenesis-related proteins in germinating wheat seeds infected with Fusarium culmorum. Plant Science 140 : 107?120.
CHELKOWSKI, J. AND MANKA ,K. (1983) The ability of Fusaria pathogenic to wheat, barley and corn to produce zearalenone. Phytopathology 106: 354-359.
COOK R.J. AND CHRISTEN A.A. (1976) Growth of cereal root rot fungi as affected by temperature- water potential interactions. Phytopathology 66: 193?197.
DAVANLOU, M.; MADSEN, A.M.; MADSEN, C.H.; AND HOCKENHULL J.(1999) Parasitism of macroconidia, chlamydospores and hyphae of Fusarium culmorum by mycoparasitic Pythium species. Plant Pathology 48: 352?359.
DESJARDINS, A.E.; PROCTOR R.H. (2001) Biochemistry and genetics of Fusarium toxins, pp,122-137 en: Fusarium, Summerell BA et al., eds. APS Press. St. Paul, Minnesota.
DOOHAN, F.M.; BRENNAN, J. AND COOKE B.M. (2OO3) Influence of climatic factors on Fusarium species pathogenic to cereals European Journal of Plant Pathology 109: 755?768.
DOOHAN, F.M.; PARRY, D.W. AND NICHOLSON, P. (1999) Fusarium ear blight: The use of quantitative PCR and visual disease assessment in the studies of disease control. Plant Pathology 48: 209?217.
GANG, G.; MIEDANER, T.; SCHUHMACHER, U.; SCHOLLENBERGER, M. AND GEIGER, H.H. (1998) Deoxynivalenol and nivalenol production by Fusarium culmorum isolates differing in aggressiveness toward winter rye. Phytopathology 88: 879?884.
GERLACH, W.; NIRENBERG, H. (1982) The genus Fusarium-Apictorial atlas. Mitt. Biol. Bundesanst. Land-Forwirtsch. Berl. Dahlem.
GONZÁLEZ, H.H.; MARTINEZ E.J.; PACIN A.M.; RESNIK, S.L.; SYDENHAM, E.W (1999) Natural co-occurrence of fuminisins, deoxynivalenol, zearalenone and aflatoxins in field trial corn in Argentina. Food Addit. Contam. 16(12): 565-569.
HESTBJERG, H.; FELDING, G.; ELMHOLT, S. (2002) Fusarium culmorum Infection of Barley Seedlings: Correlation between Aggressiveness and Deoxynivalenol Content. J. Phytopathology 150, 308?312.
HOPE, R. AND MAGAN, N. (2003) Two-dimensional environmental profiles of growth, deoxynivalenol and nivalenol production by Fusarium culmorum on a wheat-based substrate. Letters in Applied Microbiology 2003, 37, 70?74
JENSEN, B.; KNUDSEN, I. AND JENSEN, D.F. (2000) Biological seed treatment of cereals with fresh and long-term stored formulations of Clonostachys rosea: Biocontrol efficacy against Fusarium culmorum. European Journal of Plant Pathology 106: 233?242.
LACEY, J. (1989) Pre- and post-harvest ecology of fungi causing spoilage of foods and other stored products. Journal of Applied Bacteriology, Sumposium Supplement:11S-25S.
LACEY, J.; MAGAN, N.;(1991) Fungi relationships in cereal grains: their occurrence and water and temperature. En: Cereal grain. Mycotoxins, fungi and quality in drying and storage. Ed. Elsevier. Amsterdam.
LIGGITT, J.; JENKINSON, P. AND PARRY, D.W. (1997) The role of saprophytic microflora in the development of Fusarium ear blight of winter wheat by Fusarium culmorum. Crop Protection 16: 679?685.
LOGRIECO, A.; BOTTALICO, A.; MULE, G.; MORETTI, A. AND PERRONE, G. (2003) Epidemiology of toxigenic fungi and their associated mycotoxins for some Mediterranean crops. European Journal of Plant Pathology 109: 645?667.
MAGAN, M.; HOPE, R.; CAIRNS, V. AND ALDRED, D. (2003) Post-harvest fungal ecology: Impact of fungal growth and mycotoxin accumulation in stored grain. European Journal of Plant Pathology 109: 723?730.
MAGAN, N. AND LACEY, J. (1984b) Effects of gas composition and water activity on groxth of field and storage fungi and their interactions. Trans. Br. Mycol. Soc. 82:305-314.
MIEDANER, T.; GANG, G.; AND GEIGER, H.H. (1996a) Quantitative-genetic basis of aggressiveness of 42 isolates of Fusarium culmorum for winter rye head blight. Plant Disease 80: 500?504.
MIEDANER, T.; SCHILLING, A.G. AND GEIGER, H.H. (2004) Competition effects among isolates of Fusarium culmorum differing in aggressiveness and mycotoxin production on heads of winter rye. European Journal of Plant Pathology 110: 63?70.
MUTHOMI, J.W.; SCHÜTZE, A.; DEHNE, H.W.; MUTITU, E.W. AND OERKE, E.C. (2000) Characterization of Fusarium culmorum isolates by mycotoxin production and aggressiveness to winter wheat.Journal of Plant Diseases and Protection 107: 113?123.
NELSON, P.E.; TOUSSOUN, T.A.; MARASAS, W.F.O. (1983) Fusarium species: an illustrated manual for identification. Pennsylvania State University Press. University Park.
O´NEILL, K.; DAMOGLO, A.P. AND PATTERSON, M.F. (1991) Sensitivity of some common grain and in phosphate-buffered saline. Lett. Appl. Microbiol:180-183.
PARRY, D.W.; PETTITT T.R.; JENKINSON, P. AND LEESA, K. (1994) The cereal Fusarium complex. In: Blakeman P and Willamson B (eds) Ecology of Plant Pathogens (pp 301?320) CAB International, Wallingford, UK.
PARRY, D.W.; JENKINSON, P.; MCLEOD, L. (1995). Fusarium ear blight (scab) in small grain cereals: a review. Plant Pathology 44, 207?38.
PIRGOZLIEV, S.R.; EDWARDS, S.G.; HARE, M.C. AND JENKINSON, P. (2003) Strategies for the control of Fusarium head blight in cereals. European Journal of Plant Pathology 109: 731?742.
PITT, J.I.; HOCKING, A.D. (1999) Fungi and food spoilage. Aspen Publishers, Inc. Maryland.
SAMSON, R.A.; HOEKSTRA, FRISVAD, J.C.; FILTENBORG, O. (2000) Introduction to food-and airborne fungi. 6 ed. Ed. CBS. Utrecht. The Netehrlands. 389.
SANCHIS, V. (2000) Control de micotoxinas emergentes. Situación legislativa. Revista Iberoamericana de Micología 17: S69-S75.
SILVA, C.M.G. AND VARGAS, E.A. (2001) A survey of zearalenone in corn using Romer Mycosep (TM)-224 column and high performance liquid-chromatography. Food. Addit. Contam. 18 (1): 39-45.
SITTON, J.W.; COOK, R.J. (1981) Comparative morphology and survival of chlamydospores of Fusarium roseum ?Culmorum? and ?Graminearum?. Phytopathology 71, 85?90.
STEIFERT, K. (2000). Fuskey. Agriculture and Agri-Food Canada. (http://res.agr.ca/brd/fusarium).
TAN, M.K. AND NIESSEN, L. M. (2003) Analysis of rDNA ITS sequences to determine genetic relationships among, and provide a basis for simplified diagnosis of, Fusarium species causing crown rot and head blight of cereals Mycol. Res. 107 (7): 811?821. The British Mycological Society.
TANAKA, T.; HASEGAWA, A.; MATSUKI, Y.; ISHII, K. AND UENO, Y. (1985) Rapid and sensitive determination of zearalenone in cereals by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection. J. Chromatogr. 328: 271-278.
TEPERI, E.; KESKINEN, M.; KETOJA, E. AND TAHVONEN, R. (1998) Screening for fungal antagonists of seedborne Fusarium culmorum on wheat using in vivo tests. European Journal of Plant Pathology 104: 243?251.
TERAO, K.; OHTSUBO, K. (1991) Biological activities of mycotoxins: field and experimental mycotoxicoses pp.455-488 en Smith JE, Henderson RS, eds. Mycotoxins and Animal Foods. CRC Press, Boca Ratón.
UENO, Y. (1985) The toxicology of micotoxins. Crit. Rev. Toxicol. 14:99-132.
VISCONTI, A.; SOLFRIZZO, M.; AVANTAGGIATO, G. AND DE GIROLAMO, A. (2000) Strategies for detoxification of Fusarium mycotoxins and assessing in vitro the relevant effectiveness. In: Proceedings of Brighton Crop Protection Conference ? Pests and Diseases 2000:721?728.
YI, C.; KAUL, H.P.; KUBLER, E.; SCHWADORF, K. AND AUFHAMMER, W. (2001) Head blight (Fusarium graminearum) and deoxynivalenol concentration in winter wheat as affected by pre-crop, soil tillage and nitrogen fertilisation.Z. Pflanzenkrankh. Pflanzenschutz, 108(3), 217 ? 222.
