Importancia de la enfermedad: distribución geográfica y pérdidas que ocasiona

La judía común (Phaseolus vulgaris L.) es originaria de América y actualmente se cultiva en todo el mundo. Este cultivo puede ser atacado por aproximadamente 200 patógenos, aunque sólo cerca de una docena dan lugar a enfermedades que originan pérdidas económicas de mucha importancia. De entre ellas, la grasa es una de las enfermedades bacterianas de mayor importancia (SMITH et al., 1992; ALLEN et al., 1998; SCHWARTZet al., 2005).

La grasa de la judía tiene una distribución mundial y probablemente ocurre en todos los sitios en los que se cultiva la judía, aunque la enfermedad tiene mayor importancia en regiones templadas y en zonas elevadas (1500-2500 m) en los trópicos. Así, en presencia de una adecuada fuente de inóculo, las mayores pérdidas se producen con tiempo húmedo y nuboso y con temperaturas moderadas (18-22ºC). A temperaturas más altas, el patógeno puede también multiplicarse significativamente e infectar la planta, aunque es frecuente que en condiciones de alta temperatura (28-32ºC) predominen las infecciones producidas por especies de Xanthomonas, que muestran síntomas similares a los de la grasa. En España se dan ambos tipos de bacteriosis (ANDRÉS et al., 1998).

Existen sólo unas pocas estimaciones de la importancia económica de las epidemias de grasa en judía cultivada. Sin embargo, la literatura coincide en señalar que las pérdidas debidas a la grasa son cuantiosas y que en Europa es probablemente la enfermedad más importante de las judías de mata baja y de enrame, con pérdidas que pueden llegar a sobrepasar el 60% en determinadas condiciones. Bajo condiciones experimentales, se han estimado pérdidas de rendimiento de hasta el 43% en Gran Bretaña y EE.UU. Las pérdidas se deben a varias causas, que incluyen la reducción directa del rendimiento, la pérdida de calidad de las semillas y las vainas, la inhibición de la nodulación por rizobios y, en infecciones graves, la muerte de las plantas.

Sintomatología

Los síntomas típicos en hoja y en vaina (Figura 1) se corresponden con pequeñas lesiones hidrópicas de aspecto aceitoso, angulares y húmedas, que han dado lugar al descriptivo nombre de "grasa" para la enfermedad. Los síntomas aparecen en el envés de las hojas, en un periodo de entre 3 a 5 días tras la infección. Después, y a temperaturas que ronden los 16-22ºC, es frecuente que las lesiones aparezcan rodeadas de un halo ancho de color verde claro o amarillento (Figura 1) que se debe a la acción de una toxina producida por el patógeno, la faseolotoxina. La aparición de este halo es, igualmente, la razón del nombre anglosajón de la enfermedad, "halo blight". Las temperaturas superiores a, aproximadamente, 24ºC inhiben la producción de faseolotoxina y, por tanto, conducen a la producción de síntomas sin el halo característico. Igualmente, en España y en Australia, se han descrito epidemias originadas por cepas del patógeno no productoras de faseolotoxina, que también dan lugar a síntomas característicos, pero sin la formación de halos (RICO et al., 2003). En las hojas, las manchas de grasa suelen coalescer, empardecer y secarse, dando lugar a grandes áreas de tejido muerto que, eventualmente, conllevan a su caída de la planta. En el tallo y pecíolos también aparecen las lesiones hidrópicas típicas de la enfermedad que, a veces, producen exudados bacterianos cremosos y de color blanquecino. Estos exudados están compuestos por una matriz de polisacáridos bacterianos en la que se embeben un gran número de células, por lo que pueden contribuir significativamente a la dispersión del patógeno.

En vainas, las lesiones son inicialmente de aspecto graso y después suelen tornarse rojizas o parduscas y también pueden coalescer; una infección temprana da lugar a semillas que no maduran o que se pudren. Desde el centro de las lesiones pueden producirse exudados bacterianos. Las lesiones en vainas conducen a importantes pérdidas económicas por la reducción de la calidad de las vainas en judía verde, y pueden dar lugar, incluso con índices bajos de infección, a la pérdida de toda la cosecha. La infección de semillas se produce fundamentalmente a partir de la penetración directa de las bacterias en las mismas desde las lesiones adyacentes en las vainas. Las semillas infectadas pueden tener una apariencia normal, asintomática, aunque porten un número relativamente alto de bacterias. Alternativamente, las semillas pueden estar arrugadas, con manchas de color amarillento o cambios de coloración de la cubierta. Las manchas son más evidentes en semillas de color claro, pero son difíciles de distinguir en semillas de tonalidades oscuras y en las manchadas.

En ataques graves, y sobre todo si se originan a partir de semillas ya infectadas, se produce una infección sistémica que da lugar a achaparramiento, clorosis sistémica, marchitez, mosaico foliar y malformación de hojas. Estas plantas sufren defoliación y mueren tempranamente, aunque suponen un importante reservorio del patógeno para su dispersión a plantas adyacentes. Asimismo, las plántulas nacidas de semillas infectadas muestran anillado del tallo y podredumbre de nudos.

Los síntomas de grasa en judía son similares a los síntomas producidos por P. syringae pv. syringae y por Xanthomonas, aunque estos dos patógenos no producen el halo característico alrededor de las lesiones, y a menudo sólo pueden diferenciarse por personal experimentado o por aislamiento del patógeno. En España es común que una misma planta esté infectada por combinaciones de estas especies de bacterias (ASENSIO, 1995; LÓPEZ, 2003).

Etiología: morfología, taxonomía, especialización patogénica y pruebas de patogenicidad, del agente

Pseudomonas syringae pv. phaseolicola (sin. P. savastanoi pv. phaseolicola) es una bacteria grannegativa que pertenece a la familia Pseudomonadaceaede la clase Gammaproteobacteria. Es un bacilo móvil,de 0,7-1,2 × 1,5 ?m, aerobio estricto y que, comoes característico de la especie, produce pigmentosdifusibles en medios con bajo contenido en hierroque son fluorescentes bajo luz ultravioleta conun color verde-azulado (Figura 2), aunque unaminoría de aislados no los producen. P. syringae pv. phaseolicola (Pph) es un miembro típico delgrupo Ia en la batería de pruebas LOPAT, por loque da lugar a colonias tipo levano (Figura 2), dauna reacción negativa en las pruebas de la oxidasa,podredumbre de patata y arginina dihidrolasa, yproduce reacción hipersensible en tabaco (LELLIOTTy STEAD, 1987). Este patovar se caracteriza porproducir una toxina, denominada faseolotoxina,que inhibe las rutas de biosíntesis de arginina y depoliaminas; la síntesis de la toxina es termosensible,con un máximo in vitro a 18-20ºC y ausencia de latoxina a 30ºC (AGUILERA et al., 2007). No se conoceel papel de la faseolotoxina en el ciclo de vida dela bacteria, pero es importante porque los genes debiosíntesis se utilizan como diana para la detecciónsensible del patógeno por PCR (PALACIO-BIELSA et al., 2009). Sin embargo, más de dos tercios de losaislados de campo de Pph en España no producenfaseolotoxina ni contienen los correspondientesgenes de biosíntesis, lo que dificulta su detección(ver más abajo). En medios de cultivo estándar, comoel medio B de King, produce colonias aplastadas decolor crema (Figura 2). Generalmente crece bien enmedios mínimos, como MG (por litro, manitol, 10g; ác. L-glutámico, 2 g; KH2PO4, 0,5 g; NaCl, 0,2g; MgSO4 7 H2O, 0,2 g; agar, 15 g), que es uno delos más adecuados para observar la producción defluorescencia. No obstante, la mayoría de las cepasproductoras de faseolotoxina no pueden utilizarmanitol como única fuente de carbono, al contrarioque las cepas no toxigénicas (RICO et al., 2003).La temperatura óptima de crecimiento en mediosde cultivo artificiales es 28-30ºC, mientras que nocrece por encima de 30ºC. Los aislados de Pph sonresistentes a diversos compuestos antibacterianos,que incluyen nitrofurantoína, telurito potásico,trimetoprima y diversos compuestos betalactámicos,como la ampicilina, pero son generalmente sensiblesa compuestos de cobre y a estreptomicina.

P. syringae es una especie heterogénea cuya taxonomía está desde hace tiempo en revisión, por lo que su nomenclatura es a menudo objeto de confusión. En 1992 se reconoció válidamente la especie Pseudomonas savastanoi, incluyendo exclusivamente los patovares glycinea, phaseolicola y savastanoi. Los posteriores estudios de hibridación DNA-DNA y de secuenciación de DNA indican que P. syringae se podría separar en al menos nueve especies distintas (o genomoespecies, ya que no se han nombrado formalmente debido a que no existen pruebas fenotípicas que permitan diferenciarlas) (GARDAN et al.,  1999). En concreto, Pph se incluye en la genomoespecie 2, junto con otros 15 patovares de P. Syringae ?como aesculi, eriobotryae, glycinea, savastanoi y tabaci, muchos de los cuales nunca se incluyeron en la especie P. Savastanoi? y las especies P. amygdali, P.ficuserectae y P. meliae; las reglas de nomenclatura taxonómica dictan que, en su caso, el nombre correcto de esta genomoespecie debería ser P.amygdali, y no P. savastanoi. Por ello, y a pesar de que P. savastanoi es una especie válidamente reconocida, entendemos que, hasta que se resuelva adecuadamente la taxonomía y nomenclatura de la genomoespecie 2, es preferible utilizar el nombre P. syringae pv. phaseolicola para este patógeno con el fin de evitar malentendidos.

Los aislados de Pph se clasifican en nueve razas de acuerdo con su capacidad para infectar siete cultivares diferenciales de judía y uno de Phaseolus acutifolius (Tabla 1) (TAYLOR et al., 1996a). La clasificación en razas puede explicarse por la interacción específica de cinco parejas de genes de resistencia y genes de avirulencia. Tres de estos genes de avirulencia (avrPphB, avrPphE y avrPphF) se han clonado y se ha demostrado su interacción específica con los correspondientes genes de resistencia. La proporción y distribución mundial de las diferentes razas es variable (Tabla 2). La distribución de las razas 3, 4, 5 y 8 es muy limitada y, con muy pocas excepciones, se circunscribe a países de África. Por otra parte, la raza 6 se considera la más agresiva, porque es compatible con todos los cultivares diferenciales y es, en general, la más abundante. Adicionalmente, un porcentaje menor de los aislados de campo no pueden ser clasificados en ninguna de las razas hasta ahora definidas, aunque sus patrones de interacción con las variedades diferenciales sugieren que Pph podría dividirse en un total de al menos catorce razas.

La patogenicidad de los aislados de Pph se puede evaluar tanto en hojas como en vainas inmaduras, siendo preferibles las vainas debido a que las reacciones de compatibilidad e incompatibilidad aparecen más claramente. La inoculación de vainas se lleva a cabo mediante la punción de las mismas con un palillo impregnado en un cultivo bacteriano joven o mediante la inyección subepidérmica de suspensiones bacterianas (104-106 cfu/ml); las reacciones de resistencia se observan a las 24- 48 h, mientras que los síntomas de enfermedad aparecen a los 2-4 d (Figura 1). Como huésped se puede usar judía cv. Canadian Wonder, que es susceptible a todas las razas (Tabla 1) y se puede obtener comercialmente. Alternativamente, se pueden usar vainas obtenidas en comercios locales, preferiblemente del cv. Helda que, en nuestra experiencia, también es universalmente susceptible, pero no del cv. Perona, que muestra resistencia a aislados de al menos cinco razas. Igualmente, se pueden realizar inoculaciones mediante infiltración de suspensiones bacterianas en la primera hoja verdadera (unifoliada), sobre todo para la evaluación de razas. Es necesario tener en cuenta, sin embargo, que los genes de resistencia de la planta no necesariamente se expresan en todos los órganos, por lo que a veces se observan distintas reacciones de resistencia en hojas, tallos y vainas. Se pueden encontrar protocolos detallados de inoculación en diversos manuales de fitobacteriología y en la página web de la Bean Improvement Cooperative (http://www.css. msu.edu/bic/ResearchTechniques.cfm).

Además de su importancia económica, Pph es un importante modelo de investigación para el estudio de las bases moleculares de la producción de enfermedad en plantas, así como en otros campos. En la fecha de escritura de este artículo, se dispone de la secuencia del genoma de una cepa de Pph.

Ciclo vital del patógeno y epidemiología

El huésped de mayor importancia económica es la judía común (Phaseolus vulgaris), aunque Pph se ha encontrado produciendo infecciones naturales en diversas especies de leguminosas pertenecientes a trece géneros -que incluyen, por ejemplo, Desmodium spp., Glycine max, Macroptilium atropurpureum, Neonotonia wightii, diversas especies de Phaseolus, Pisum sativum, Pueraria lobata, y diversas especies de Vigna-. El espectro de huésped es posiblemente más amplio, ya que Pph infecta a un mayor número de especies y géneros en inoculaciones artificiales.

La enfermedad en campo se origina fundamentalmente a partir de semillas infestadas, en las que la bacteria puede encontrarse en el interior o en la superficie, aunque también pueden servir como inóculo primario malas hierbas o, infrecuentemente, restos vegetales infestados. Además, Pph puede vivir epifíticamente, incluso sin producir síntomas, tanto en huéspedes susceptibles como resistentes y en plantas que no son su huésped. En campo se dispersa por salpicaduras de agua de lluvia o de riego, y por contacto entre plantas húmedas, ya sea facilitado por el viento, por la actividad humana o por otras causas. El potencial de dispersión es alto, ya que se ha documentado la dispersión del patógeno a plantas alejadas hasta 26 m de la fuente de inóculo. La bacteria penetra en la planta a través de aberturas naturales, como estomas o hidatodos (Figura 1), o por heridas en presencia de agua libre o alta humedad relativa.

Las semillas se infectan mediante contacto directo con las lesiones en la vaina, de manera que las vainas o zonas que no tienen lesiones dan lugar a semillas sanas (TAYLOR et al., 1979a). En la semilla, el patógeno se aloja principalmente en el tejido parenquimático de la cubierta o en la superficie del embrión; una semilla puede contener hasta cerca de 4 × 107 bacterias en su interior. En condiciones de laboratorio, sin embargo, la mayoría de las semillas infestadas dan lugar a plantas sanas. La viabilidad de las bacterias en semilla es limitada, posiblemente de no mucho más de seis años en condiciones controladas, aunque es suficiente para cubrir la vida útil de la semilla.

El patógeno puede dar lugar a epidemias importantes incluso con bajos niveles de inóculo (TAYLOR et al., 1979b; WEBSTER et al., 1983). Se ha estimado que lotes con menos de 1 semilla infectada entre 20.000 semillas sanas (10-13 kg, para una semilla de tamaño medio) no dan lugar a síntomas incluso bajo las condiciones más favorables para el desarrollo de la grasa; sin embargo, aparecen epidemias graves con 5 semillas infectadas entre 1.000 (0,5-0,7 kg) y se han observado importantes pérdidas con niveles de infección de 5 en 10.000 y 1 en 16.000.

Control

El control de la grasa de la judía es difícil, fundamentalmente por la gran velocidad de dispersión del patógeno en condiciones favorables. Las medidas de control más efectivas son la utilización de semilla certificada libre del patógeno y de variedades resistentes o tolerantes, aunque se recomienda la combinación de diversos tratamientos y métodos para obtener un control satisfactorio (TAYLOR et al., 1979b).

Es recomendable que la semilla para certificación se produzca en una zona árida y con riego de pie para minimizar las infecciones de grasa. Igualmente, el riego por aspersión debe limitarse en cultivos comerciales, con el fin de minimizar la dispersión del patógeno. Los límites tolerables de infección de semilla son muy bajos, por lo que es necesario utilizar técnicas de detección del patógeno que sean muy sensibles y específicas, además de rápidas y baratas. Actualmente, la detección se basa en técnicas serológicas y, fundamentalmente, en la amplificación de DNA por PCR. En el mercado existen diversos anticuerpos policlonales y estuches de diagnóstico serológico. Sin embargo, los anticuerpos comerciales reaccionan muy débilmente con los aislados no toxigénicos de Pph en ensayos ELISA (A. MARTÍNEZ-BILBAO y J. MURILLO, resultados sin publicar; RICO et al., 2003), lo que podría dar lugar a falsos negativos, aunque sí permiten la detección de estos aislados mediante inmunofluorescencia. Los protocolos de detección por PCR más comunes se basan en la amplificación específica de genes de biosíntesis de faseolotoxina, y permiten alcanzar una sensibilidad mucho mayor que las técnicas serológicas (PALACIO-BIELSA et al., 2009). Igualmente, estos protocolos no permiten la detección de cepas no toxigénicas, que aparecen mayoritariamente en campos comerciales en España y que también están presentes en otros países del mundo (Rico et al., 2003; Rico et al., 2006).

La utilización de resistencia es el método más deseable y eficiente para el control de la grasa, y existen numerosos programas de mejora para el desarrollo de variedades resistentes a esta enfermedad. En judía se ha descrito la existencia de resistencia específica de raza (vertical o cualitativa; Tabla 1), mediada por un único gen dominante o recesivo, y de resistencia horizontal (resistencia cuantitativa) (TAYLOR et al., 1996b; ASENSIO-SMANZANERAet al., 2006; BEAVER y OSORNO, 2009). La utilización de resistencia vertical está limitada por el alto número de razas de Pph, la variación temporal de la estructura de razas en campo, la expresión diferencial de genes de resistencia en hojas y vainas, la selección de variantes de Pph que pueden superar la resistencia, y por la tradicional falta de resistencia a la raza 6, aunque recientemente se ha identificado un cultivar (pinto US 14) con resistencia a esta raza. Por su parte, la utilización de la resistencia horizontal está limitada por la dificultad práctica de su transferencia a variedades comerciales, aunque se está avanzando en la selección asistida por marcadores moleculares.

Los métodos de control químico pueden no ser rentables, y no siempre dan un resultado satisfactorio (TAYLOR et al., 1979b). Las semillas pueden ser tratadas con polvos mojables de estreptomicina o kanamicina para eliminar las bacterias que se encuentren en la superficie, reduciendo el inóculo primario. Igualmente, y sobre todo cuando hay una alta tasa de progresión de la enfermedad, es recomendable la aplicación sistemática de tratamientos cúpricos, que eliminan la población epifita y pueden llegar a controlar las infecciones foliares y en vaina. En cualquier caso, la simulación epidemiológica sugiere que el control será más efectivo mediante la combinación de tratamientos, como por ejemplo la selección de semilla libre del patógeno unido al tratamiento químico de las mismas.

Medidas preventivas y complementarias, como la eliminación de las malas hierbas y restos vegetales, pueden favorecer el control de la enfermedad y, por otra parte, la rotación trienal de cultivos es una práctica recomendable. No está muy clara la efectividad en control del cultivo asociado judía-maíz, ya que puede conducir tanto al incremento como a la disminución de la incidencia y severidad de grasa.

Agradecimientos: Los autores agradecen la financiación del proyecto de investigación AGL2008- 05311 C02-01, que ha permitido la escritura de este artículo.

BIBLIOGRAFÍA

AGUILERA, S.; LÓPEZ-LÓPEZ, K.; NIETO, Y.; GARCIDUEÑAS-PIÑA, R.; HERNÁNDEZ-GUZMÁN, G.; HERNÁNDEZ-FLORES, J. L.; MURILLO, J.; ALVAREZ-MORALES, A. (2007). Functional characterization of the gene cluster from Pseudomonas syringae pv. phaseolicola NPS3121 involved in synthesis of phaseolotoxin. Journal of Bacteriology 189: 2834-2843.

ALLEN, D. J.; BURUCHARA, R. A.; SMITHSON, J. B. (1998). Diseases of common bean. En D. J. Allen y J. M. Lenné [eds.], The pathology of food and pasture legumes. CAB International, Wallingford, UK.

ANDRÉS, M. F.; GARCÍA-ARENAL, F.; LÓPEZ, M. M.; MELGAREJO, P. (1998). Patógenos de plantas descritos en España. Ed. Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación, Madrid ASENSIO-S-MANZANERA, M. C.; ASENSIO, C.; SINGH, S. P. (2006). Gamete selection for resistance to common and halo bacterial blights in dry bean intergene pool populations. Crop Science 46: 131-135.

ASENSIO, C. 1995. Bacteriosis de judías en Castilla y León: identificación de la variación patogénica de Pseudomonas syringae pv. phaseolicola y factores que influyen en su desarrollo. Estudio de la herencia de la resistencia a la raza 1 de P.s. pv. phaseolicola, Universidad de León, Spain.

BEAVER, J. S.; OSORNO, J. M. (2009). Achievements and limitations of contemporary common bean breeding using conventional and molecular approaches. Euphytica 168: 145-175.

GARDAN, L.; SHAFIK, H.; BELOUIN, S.; BROCH, R.; GRIMONT, F.; GRIMONT, P. A. D. (1999). DNA relatedness among the pathovars of Pseudomonas syringae and description of Pseudomonas tremae sp. nov. and Pseudomonas cannabina sp. nov. (ex Sutic and Dowson 1959). International Journal of Systematic Bacteriology 49: 469-478.

LELLIOTT, R. A.; STEAD, D. E. (1987). Methods for the diagnosis of bacterial diseases of plants. Ed. Blackwell Scientific Publications, Oxford, 2.

LÓPEZ, R. 2003. Caracterización de patógenos implicados en bacteriosis de judía-grano (Phaseolus vulgaris L.) en Castilla y León, puesta a punto de un método de inoculación y búsqueda de fuentes de resistencia en variedades locales, Universidad de Valladolid, Spain.

PALACIO-BIELSA, A.; CAMBRA, M. A.; LÓPEZ, M. M. (2009). PCR detection and identification of plant pathogenic bacteria: updated review of protocols (1989-2007). Journal of Plant Pathology 91: 249-297.

RICO, A.; LOPEZ, R.; ASENSIO, C.; AIZPUN, M. T.; ASENSIO-S-MANZANERA, M. C.; MURILLO, J. (2003). Nontoxigenic strains of Pseudomonas syringae pv. phaseolicola are a main cause of halo blight of beans in Spain and escape current detection methods. Phytopathology 93: 1553-1559.

RICO, A.; ERDOZÁIN, M.; ORTIZ-BARREDO, A.; RUIZ DE GALARRETA, J. I.; MURILLO, J. (2006). Detection by multiplex PCR and characterization of nontoxigenic strains of Pseudomonas syringae pv. phaseolicola from different places in Spain. Spanish Journal of Agricultural Research 4: 261-267.

RIVAS, L. A.; MANSFIELD, J.; TSIAMIS, G.; JACKSON, R. W.; MURILLO, J. (2005). Changes in race specific virulence in Pseudomonas syringae pv. phaseolicola are associated with a chimeric transposable element and rare deletion events in a plasmid-borne pathogenicity island. Applied and Environmental Microbiology 71: 3778-3785.

SCHWARTZ, H. F.; STEADMAN, J. R.; HALL, R.; FORSTER, R. L. (2005). Compendium of bean diseases. APS Press, American Phytopathological Society, St. Paul, Minn.

SMITH, I. M.; DUNEZ, J.; LELLIOTT, R. A.; PHILLIPS, D. H.; ARCHER, S. A. (1992). Manual de enfermedades de las plantas. Ed. Mundi-Prensa, Madrid

TAYLOR, J. D.; DUDLEY, C. L.; PRESLY, L. (1979a). Studies of halo-blight seed infection and disease transmission in dwarf beans. Annals of Applied Biology 93: 267-277.

TAYLOR, J. D.; PHELPS, K.; DUDLEY, C. L. (1979b). Epidemiology and strategy for the control of halo blight of beans. Annals of Applied Biology 93: 167-172.

TAYLOR, J. D.; TEVERSON, D. M.; ALLEN, D. J.; PASTOR-CORRALES, M. A. (1996a). Identification and origin of races of Pseudomonas syringae pv. phaseolicola from Africa and other bean growing areas. Plant Pathology 45: 469-478.

TAYLOR, J. D.; TEVERSON, D. M.; DAVIS, J. H. C. (1996b). Sources of resistance to Pseudomonas syringae pv. phaseolicola races in Phaseolus vulgaris. Plant Pathology 45: 479-485.

WEBSTER, D. M.; ATKIN, J. D.; CROSS, J. E. (1983). Bacterial blights of snap beans and their control. Plant Disease 67: 935-940.