La introducción del virus de la tristeza en nuestro país en el año 1957 ha provocado una reconversión de la citricultura española mediante el establecimiento de medidas legales que han ido acompañadas de un programa de selección y mejora sanitaria de cítricos. Debido a la susceptibilidad que presentan las plantas injertadas sobre naranjo amargo, en 1968 se prohibió su propagación y se optó por la utilización de patrones tolerantes que a pesar de no poseer las excelentes propiedades agronómicas del naranjo amargo, ha sido de gran ayuda para contrarrestar el devastador efecto de este virus. Dentro de la gama de patrones tolerantes a tristeza tenemos el Poncirus trifoliata, sus híbridos citrange Troyer y citrange Carrizo, el mandarino Cleopatra, el Citrus volkameriana, la lima Rangpur, el limón rugoso y el citrumelo. Entre estos patrones se ha optado por aquellos que mejor se adaptan a nuestras condiciones de cultivo y a nuestros cultivares de naranjo, mandarino y clementino.
De los 18 millones de plantones producidos en la Comunidad Valenciana en los últimos cinco años, el 70% están injertados sobre citrange Carrizo, el 11% sobre Citrus macrophylla, el 7% sobre Citrus volkameriana, el 5,4% sobre mandarino Cleopatra, y el 3,2% sobre citrumelo.
Cabe destacar que el segundo patrón más utilizado, el Citrus macrophylla, es una especie sensible a la tristeza pero su uso compensa económicamente las mermas ocasionadas por esta enfermedad debido a su buen establecimiento en campo y a la temprana y elevada producción de fruta de calidad que aporta a los cultivares comerciales. Otro gran pilar en la reconversión citrícola ha sido el saneamiento de nuestros cultivares mediante la técnica de microinjerto de ápices caulinares in vitro que permite obtener plantas libres de patógenos con capacidad de producir frutos en dos o tres años. Gracias a esta técnica se han obtenido plantas madres saneadas que son el origen de los cítricos producidos en el programa de certificación de plantas libres de patógenos. Para poder garantizar su sanidad, el programa realiza un seguimiento en distintas etapas del proceso productivo mediante métodos de diagnóstico específicos para cada patógeno.
La actuación que ha habido frente al virus de la tristeza y el programa de certificación son un buen ejemplo de I+D+i (investigación desarrollo e innovación). A partir del conocimiento generado en la investigación básica (identificación de agentes causales de enfermedades, identificación de tejidos de la planta excluidos de la infección e identificación de genotipos tolerantes) se han desarrollado estrategias y técnicas (microinjerto de ápices, métodos de diagnóstico) con el fin de transferir esta tecnología y ofrecer un producto innovador (plantas certificadas sobre patrones tolerantes) para solucionar la problemática situación en la que se encontraba el sector citrícola. Sin embargo, tener una citricultura saneada y tolerante al virus de la tristeza no nos garantiza su protección frente a otras enfermedades y por tanto, es necesario seguir generando conocimiento para poder anticiparse a la entrada de otros agentes patógenos. Dentro de este marco nos ha parecido oportuno escribir este artículo para prevenir sobre el impacto que causan los viroides de los cítricos.
Los viroides son los agentes fitopatógenos más simples que conocemos. Un viroide es una molécula de RNA monocatenario circular con un tamaño diez veces inferior a los virus más pequeños que se han descrito. El ciclo infectivo de los viroides consta de distintas etapas en las que destacan su entrada en la célula huésped, la utilización de la maquinaria replicativa celular para multiplicarse, la invasión de células vecinas a través de los plasmodesmos, la entrada en el sistema vascular y su difusión a partes distales de la planta. A diferencia de los virus que codifican proteínas que median algunas etapas de su ciclo infectivo, la molécula viroidal no es codificante y debe interactuar directamente con factores del huésped para llevar a cabo todos los pasos necesarios para el desarrollo de la infección. Aunque la mayoría de huéspedes se muestran asintomáticos frente a la infección viroidal, en algunos casos la interacción viroide-huésped puede inducir la aparición de síntomas que en especies de interés agronómico se conciben como patologías. Los cítricos son un buen ejemplo en este sentido ya que la mayoría de ellos son especies tolerantes que no presentan síntomas evidentes al infectarse a pesar de ser huéspedes naturales de cinco especies de viroides (Tabla 1). Esta ausencia de síntomas específicos ha provocado que, con la excepción de cultivares que han sido objeto de programas de mejora, en muchas ocasiones se utilicen plantas madres infectadas para reproducir cítricos comerciales por propagación vegetativa. Las plantas obtenidas de este modo son, al igual que las plantas madre, portadoras de la infección y como consecuencia los viroides se encuentran altamente difundidos en los países citrícolas presentando las plantas en la mayoría de casos infecciones mixtas que incluyen más de un viroide.
A pesar de que la mayoría de cítricos son tolerantes a las infecciones viroidales existen algunas especies sensibles a enfermedades causadas por viroides. Estas patologías son:
Exocortis de los cítricos: esta enfermedad está causada por el viroide de la exocortis de loscítricos (CEVd) y afecta a los patrones Poncirustrifoliata, citrange Troyer y Carrizo, lima Rangpur, así como a algunas variedades de lima, limón y pummelo. Los síntomas característicos son la formación de grietas verticales y descamaciones en la corteza en los patrones citrange Troyer y citrange Carrizo que dada su similitud pueden confundirse con los síntomas de la gomosis causada por Phytophthora. Ambos tipos de lesiones son perfectamente distinguibles ya que al levantar las escamas producidas por la exocortis se observa que en general afectan solo al patrón y su madera es de color blanco, mientras que las descamaciones causadas por Phytophthora pueden afectar también a la variedad y suelen ir acompañadas de exudaciones de goma, por lo que el tronco presenta un color pardo. Los árboles afectados por exocortis presentan un tamaño inferior al esperado, es decir enanismo, que puede llegar a ser muy acusado e ir asociado a un amarilleamiento progresivo, seca de ramillas y decaimiento general de la copa.
Cachexia de los cítricos: esta enfermedad, también llamada xiloporosis, está causada por variantes del tipo CVd-IIb del viroide del enanismo dellúpulo (HSVd). La cachexia afecta tanto a especies que se utilizan como patrón como a especies que se utilizan como variedad. Son especialmente sensibles el Citrus macrophylla, los mandarinos, los clementinos y los tangelos. Las plantas enfermas presentan hendiduras en la madera que se corresponden con heridas en la cara cambial de la corteza acompañadas de una decoloración del floema y de exudaciones gomosas que son especialmente evidentes en la zona de unión del patrón con la variedad. En estadios avanzados, las plantas pueden mostrar chancros en tronco y ramas, clorosis foliar y enanismo. En condiciones favorables para la aparición de síntomas la cachexia puede acarrear la muerte de la planta.
Los daños ocasionados por estas enfermedades son variables y dependen de la estirpe del patógeno, la edad del árbol en el momento que tiene lugar la infección y las condiciones climáticas del cultivo.
Dentro de una misma especie de viroide existen distintas razas y algunas de ellas son especialmente agresivas porque provocan una sintomatología muy acusada. Respecto a la edad del árbol en el momento de la infección, es muy importante entender que la productividad de una especie leñosa depende en gran medida del porte que adquiere el árbol en sus primeras etapas de desarrollo y que el enanismo que provoca la infección viroidal puede dar lugar a crecimientos anómalos. En este sentido, árboles obtenidos a partir de yemas infectadas no tendrán un crecimiento óptimo y en consecuencia serán menos productivos que árboles que se infectan cuando ya han alcanzado un buen porte. Como norma general en las enfermedades de etiología viroidal, y aquellas que afectan a los cítricos no son una excepción, los síntomas son más acusados con altas intensidades lumínicas y elevadas temperaturas. Este efecto se puede comprobar comparando la sintomatología que presentan cultivos de diferentes regiones españolas.
Mientras que en las condiciones de la Comunidad Valenciana existen árboles infectados de exocortis que manifiestan enanismo y decaimiento general sin presentar grietas y escamas en la corteza del patrón, en zonas más calurosas como Murcia y Andalucía las plantas presentan toda la gama de síntomas incluyendo descamaciones y agrietamientos en los patrones.
De igual modo se observa una sintomatología acusada de cachexia en limoneros injertados sobre Citrus macrophylla de la región de Murcia mientras que en la Comunidad Valenciana los clementinos y mandarinos solo excepcionalmente manifiestan las lesiones características de esta enfermedad.
El equipo del laboratorio de viroides dirigido por la Dra. Nùria Duran-Vila que pertenece al Centro de Protección Vegetal y Biotecnología del Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias (I.V.I.A) lleva 27 años trabajando en diversas áreas del estudio de los viroides de los cítricos. En sus comienzos, en el año 1982, únicamente se conocía la existencia de CEVd y gracias a los trabajos realizados en este laboratorio, en el año 1986 se descubrieron otros cuatro viroides en aislados que supuestamente inducían exocortis. La identificación de nuevos viroides de cítricos es un campo que sigue abierto y no deja de sorprendernos ya que en el año 2007 hemos identificado en España un nuevo viroide no descrito anteriormente, al que hemos denominado viroide V de los cítricos (CVd-V) cuyos efectos en campo desconocemos. Por otro lado, en el año 2004 se ha identificado en Japón un nuevo viroide denominado CVd-OS cuya presencia no se ha descrito por el momento en nuestro país.
Dada la escasa información existente acerca del impacto que tienen los viroides en los cultivos citrícolas, desde el año 1989 llevamos realizando una serie de ensayos de campo para evaluar y cuantificar los daños ocasionados por este tipo de infección. Ensayos realizados en Córcega utilizando clementinos injertados sobre Poncirus trifoliata, un parental de los patrones citrange muy adaptado a suelos ácidos como los de esta zona, han permitido determinar el efecto que produce la infección de cada uno de los viroides. A pesar de que únicamente CEVd y HSVd están considerados como agentes causales de patologías cítricas, en este estudio se ha podido comprobar que en esta combinación variedad-patrón todas las especies de viroides inducen síntomas y/o ejercen un efecto enanizante especialmente acusado para CEVd y CDVd que se correlaciona perfectamente con una merma de la cosecha y del calibre del fruto. En este mismo estudio también se han realizado ensayos para evaluar el efecto de infecciones mixtas utilizando todas las posibles combinaciones de viroides. Los resultados indican que en infecciones múltiples los viroides desarrollan efectos sinérgicos ya que la presencia de algunos de ellos agrava significativamente los daños producidos por viroides más agresivos mientras que en infecciones simples estos viroides tienen muy poca incidencia. La combinación que consta de CEVd, CBLVd, HSVd y CDVd es la más agresiva ya que induce los efectos más dramáticos.
Paralelamente, a los ensayos de Córcega se ha realizado un ensayo de campo en las condiciones de cultivo de la Comunidad Valenciana utilizando clementinos y naranjos injertados sobre citrange Carrizo que son las especies más características de esta zona. En este ensayo se ha evaluado el efecto que tiene la mezcla de viroides de CEVd, CBLVd, HSVd y CDVd, que a pesar de ser muy agresiva suele encontrarse con relativa frecuencia en cultivos no saneados. Los resultados obtenidos indican que la infección afecta al desarrollo del árbol en ambas especies. Mientras que los naranjos infectados únicamente presentan troncos de menor diámetro, los clementinos se ven más afectados y presentan una reducción del 20% de altura y de un 50% del volumen de la copa. Respecto a la productividad, la infección viroidal causó una merma de la cosecha acumulada los últimos 6 años del 43% en clementino y del 33% en naranjo. El análisis de los frutos indicó que la infección viroidal afecta la calidad de la fruta induciendo la formación de frutos de mayor peso y calibre pero de menor acidez y con un menor contenido en sólidos solubles. A pesar de que los resultados obtenidos indican un claro efecto provocado por la infección viroidal, en las condiciones de cultivo de la Comunidad Valenciana este tipo de infección es difícil de identificar a simple vista y puede pasar desapercibida. En este ensayo ninguna planta mostraba en el patrón las descamaciones y grietas características de exocortis.
Fue al arrancar los árboles cuando se observó que los infectados solo presentaban descamaciones en la corteza de las raíces principales, lo que puede hacer aún más difícil distinguir estos síntomas con los de Phytophthora.
El desarrollo y la continua mejora de métodos de detección es una de las principales labores del laboratorio de viroides del I.V.I.A. Las técnicas que hemos desarrollado son transferidas al programa de certificación de plantas libres de patógenos donde se utilizan de forma rutinaria. La fiabilidad de nuestros diagnósticos nos han hecho ser miembros del Laboratorio de Referencia para el Diagnóstico deVirus, Viroides y Fitoplasmas en Especies Leñosas del Ministerio de Medio Ambiente y Medio Rural yMarino. En los últimos años hemos desarrollado una metodología de hibridación molecular que nos permite diagnosticar directamente plantas infectadas sin la necesidad de realizar bioensayos en huéspedes experimentales que requieren largos periodos de incubación y costosas condiciones de cultivo. Esta técnica permite realizar con relativa facilidad diagnósticos a gran escala en parcelas con árboles que presentan crecimiento anómalo y son sospechosos de estar infectados con viroides a pesar de haber sido plantados después de instaurarse el programa de certificación. Los resultados han confirmado nuestras sospechas al evidenciar la existencia de árboles infectados. La identificación de los viroides presentes en cada planta analizada nos ha permitido intuir el origen de la infección y la transmisión de un árbol a otro, lo que ilustra el tipo de mala práctica agrícola que se ha llevado a cabo. En la mayoría de las parcelas analizadas hemos comprobado que todos los árboles infectados poseen la misma mezcla de viroides lo que indica que estas plantas provenían de la propagación de una misma fuente de material vegetal infectado. La disposición correlativa de los árboles con síntomas indica que en estas parcelas se plantaron filas de árboles certificados y filas de árboles producidos a partir de propagaciones de material infectado (no certificado). Otra situación que hemos observado es una parcela que contiene árboles que presentan descamaciones en la corteza del patrón y crecimientos anómalos dispersos entre árboles sin síntomas. El diagnóstico de esta parcela indica que todos los árboles con síntomas están infectados con la misma combinación de viroides agresiva descrita anteriormente. Sin embargo, aquellos que no presentan síntomas están sanos o infectados únicamente por uno o dos de los viroides identificados en las plantas con síntomas. Este hecho es atribuible a la transmisión mecánica mediada por herramientas de poda no desinfectadas entre labores de un árbol a otro. Se ha comprobado que este tipo de transmisión no suele transmitir todos los viroides que se incluyen en una infección múltiple. En esta parcela parece que se plantaron de forma aleatoria árboles certificados y árboles propagados a partir de material vegetal infectado y es en estas situaciones cuando cobra importancia tomar las medidas adecuadas de desinfección de herramientas de poda entre la labor de un árbol y otro para evitar la difusión de los viroides.
Los árboles infectados que no presentan síntomas, a diferencia de los que si los presentan, se infectaron cuando ya tenían un buen porte y es por ello que se ven muy poco afectados.
En este artículo hemos querido explicar el efecto que producen los viroides en la citricultura.
A pesar de que este tipo de patógeno no tiene un impacto tan dramático como lo puede tener el virus de la tristeza, nos parece importante avisar sobre el potencial daño que puede provocar este tipo de infección teniendo en cuenta que los dos patrones más utilizados son especies sensibles a enfermedades de etiología viroidal. Se ha realizado y se siguen realizando esfuerzos desde los centros de investigación para obtener y mantener una citricultura saneada. Sin embargo, entendemos que los máximos responsables y los más comprometidos en el mantenimiento de la sanidad de los cultivos deberían ser los agricultores y las cooperativas agrícolas que los orientan. Es por ello que emitimos unas practicas que nos parecen imprescindible seguir para evitar problemas de causa viroidal:
1 Utilización de material de propagación sano. Sólo las plantas certificadas suministradas por viveros autorizados tienen la garantía de hallarse libres de viroides. Los plantones no certificados pueden estar infectados con viroides y el aspecto que presentan en el momento de su adquisición y durante los primeros años de cultivo no garantiza su estado sanitario ya que las plantas suelen manifestar problemas después de 4-5 años de iniciado el cultivo.
2 Utilización de yemas procedentes de plantas sanas para el injerto de patrones suministrados por un vivero o producidos por el propio agricultor, y para el sobreinjerto para realizar un cambio de variedad. Sólo las yemas suministradas por los viveros autorizados tienen garantía de encontrarse libre de patógenos. Las yemas procedentes de plantas sin síntomas pueden ser portadoras de viroides y por tanto no deben utilizarse como material de propagación o para sobreinjerto. Las yemas procedentes de plantas establecidas inicialmente con material certificado pueden haberse infectado durante el cultivo y por tanto no tienen la garantía de hallarse libre de viroides aunque no manifiesten síntomas.
3 Evitar la difusión de los viroides mediante la transmisión mecánica durante las operaciones de injerto, poda y recolección. A diferencia de los virus, los viroides son muy estables y pueden transmitirse con cualquier instrumento capaz de efectuar heridas en el árbol (navaja, tijeras, sierra o serrucho). Solo la desinfección utilizando una solución de hipoclorito sódico (lejía comercial) es eficaz. La desinfección de los instrumentos de corte y poda es una práctica ineludible para los viveristas ya que un solo árbol madre infectado puede suponer el suministro de miles de plantones infectados.
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