Determinar el grado de contaminación de las aguas superficiales y subterráneas por herbicidas es uno de los objetivos fundamentales de muchos laboratorios analíticos. Dicho trabajo requiere el uso de métodos multiresiduos sensible para detectar e identificar el mayor número posible de compuestos, con el menor número de pasos intermedios.

Para alcanzar los bajos limites fijados por la Unión Europea en materia de productos fitosanitarios en aguas (0,1 ?g/L) es necesario el empleo de técnicas para preconcentrar las muestras acuosas.

La extracción en fase sólida (SPE) es hoy en día una de las técnicas mas empleadas para este fin.

Por otra parte, no sólo es importante la detección y cuantificación de los herbicidas presentes en las aguas, sino también de sus productos de degradación ya que estos compuestos, generados a partir de la transformación de las sustancias activas, pueden disminuir la calidad de las aguas, ya que algunos de estos productos de degradación pueden ser tan tóxicos, activos y/o persistente que sus productos de partida.

En el presente trabajo se ha optimizado la técnica de la extracción en fase sólida y la detección mediante HPLC-DAD para tres herbicidas empleados en el cultivo de la remolacha azucarera en España; fenmedifam, etofumesato y metamitron así como para tres productos de su degradación; 2-aminofenol, toluidina y metamitron-desamino.

 

INTRODUCCIÓN

Durante muchos años, la agricultura intensiva ha dado lugar a un uso masivo de productos fitosanitarios en los países desarrollados. Como resultado, los herbicidas que han sido ampliamente empleados en zonas con fines agrícolas pueden alcanzar aguas superficiales y subterráneas mediante procesos como lixiviación, deriva, escorrentía? y por tanto estas sustancias pueden llegar a ser importantes contaminantes en el medio acuático. Por ello, es necesario llevar a cabo la monitorización y control de estos compuestos no sólo en áreas donde se aplican sino también en áreas más o menos próximas.

Esta contaminación de las aguas superficiales y subterráneas va a estar gobernada por las características físico-químicas de los compuestos (solubilidad en agua, velocidad de degradación, Koc), las propiedades del medio en las cuales son aplicados y otros factores externos como la topología de la zona.

En el pasado muchos de los productos fitosanitarios empleados presentaban una baja solubilidad en agua. Sin embargo, bastantes productos fitosanitarios empleados en la actualidad presentan una mayor polaridad y por lo tanto un aumento en su solubilidad en agua, lo que representa un mayor riesgo de contaminación de aguas superficiales y subterráneas.

Además, el interés por la determinación de productos fitosanitarios en muestras acuosas ha aumentado desde el establecimiento por parte de la Unión Europea de un valor máximo general para la concentración de productos fitosanitarios en aguas de consumo humano de 0,1 ?g/L para cada compuesto individualmente y 0,5 ?g/L para el total de productos fitosanitarios (ANÓNIMO, 1998).

La cromatografía liquida y de gases acoplada a diferentes sistemas de detección (VANDECASTEELE y col, 2000) son las herramientas más poderosas actualmente para el análisis de productos fitosanitarios en las aguas.

Sin embargo, para poder alcanzar los bajos niveles de concentración permitidos en las aguas de consumo humano, es necesario un paso de concentración preliminar antes del análisis cromatográfico (SABIK y col., 2000). La extracción en fase sólida es hoy en día la técnica mas apropiada para el enriquecimiento de productos fitosanitarios en matrices acuosas.

En comparación con la técnica de extracción tradicional líquido-líquido, la SPE presenta numerosas ventajas como son la reducción del tiempo de análisis y el consumo de disolventes orgánicos de extracción, posibilita una fácil automatización para la extracción de múltiples muestras y aumenta el enriquecimiento de trazas entre otras (BALINOVA, 1993).

Para la extracción de productos fitosanitarios en fases acuosas, los adsorbentes más adecuados son las fases estacionarias reversas, principalmente las silicas n-alquilicas modificadas, materiales poliméricos y adsorbentes de carbón.

La extracción es un paso crítico para el análisis multiresiduos de productos fitosanitarios en aguas. Idealmente, este procedimiento debería permitir grandes factores de concentración para todos los analitos. Sin embargo, debido a los mecanismos de interacción selectiva de la mayoría de los adsorbentes de SPE, esto es una tarea difícil cuando los analitos presentan diferentes propiedades físico químicas (polaridad, acidez, solubilidad?). Por ello es necesario la optimización de diversos parámetros implicados en la técnica de SPE como son entre otros la elección de adsorbente, el disolvente y volumen de elución.

Por otra parte, las consecuencias del uso de herbicidas no se conocen por completo ya que una vez aplicados la mayoría son transformados por procesos físicos, químicos y biológicos en uno o más productos de degradación. Debido a su aplicación, estos compuestos son introducidos en el medioambiente y se van a distribuir en los distintos compartimentos aguas, suelo y aire. Muchos productos de degradación presentan una mayor polaridad que la sustancia activa y por lo tanto un aumento en su solubilidad, lo que va a favorecer su movilidad a las aguas (SOMASUNDARAM y col, 1991).

 

 

Actualmente, existe una creciente preocupación por los productos de degradación de productos fitosanitarios ya que en algunos casos estos compuestos pueden ser tan tóxicos y/o más activos (BAKER y col, 1993), resistentes en el medioambiente que sus productos de partida (KOLPIN y col, 1998).

Por lo tanto, es importante el desarrollo de método analítico para la determinación no solo de las sustancias activas sino también de sus productos de degradación.

En España, la remolacha azucarera es uno de los cultivos industriales con mayor importancia y con un elevado consumo de herbicidas por hectárea.

Entre estos herbicidas se encuentran el etofumesato, metamitron y fenmedifan con dosis de aplicación de entre 1 y 2 Kg m.a./ha.

Estos herbicidas con carácter polar presentan una alta capacidad de lixiviación (MOLINA y col, 1996) y por lo tanto de contaminación de aguas subterráneas.

En España el 62% del cultivo de la remolacha azucarera es en regadío (MAPA, 2007). Algunos de estos compuestos ya han sido detectados en aguas superficiales y subterráneas en la comunidad de Castilla-León (CARABIAS y col, 2003a, CARABIAS y col, 2003b).

En el caso del fenmedifam, diversos estudios demuestran su rápida degradación en aguas subterráneas y superficiales (D?ARCHIVIO, 2007) lo que pone de manifiesto la importancia del desarrollo de métodos analíticos para la determinación de sus productos de degradación en aguas naturales. Por otra parte diversos estudios ponen de manifiesto la dificultad de análisis de estos compuestos y los productos de degradación (EISERT y col, 1993). Actualmente existen muy pocos estudios sobre el desarrollo de métodos para la determinación de estos productos de degradación.

En el presente trabajo, se ha optimizado un método para la separación y preconcentración simultánea mediante extracción en fase sólida de tres herbicidas polares ampliamente empleados en cultivo de la remolacha azucarera y tres de sus productos de degradación. Los compuestos estudiados fueron: metamitron, fenmedifam y etofumesato y sus metabolitos 2 aminofenol, toluidina y metamitron-desamino. En la Figura 1 se muestran las estructuras químicas de los compuestos que se han estudiado.

 

 

Material y métodos

Patrones y disolventes

Los patrones analíticos de metamitron (4-amino-3 metil -6-fenil-1,2,4-triazin-5-(4H)-ona, 98.5%),

etofumesato ((±)-2-ethoxi-2,3-dihidro-3,3-dimetil-5-benzofuranil metanosulfonato, 98,5%), fenmedifan (3[(metoxicarbonil)amino]fenil(3-metilfenill) carbamato, 98,5%), 2-aminofenol (2-amino-1-hidroxibenzeno 99.5%), toluidina (m-toluidina, 99,%), metamitron-desamino (3-metil-6-fenil-1,2,4-triazin-5(4H)-ona 98,5%) (Figura 1) fueron adquiridos en Dr. Ehrenstorfer (Augsburg, Alemania).

Los disolventes empleados para el análisis cromatográfico, preparación de muestras y extracción en fase sólida fueron acetonitrilo (Far UV), metanol, acetato de etilo, acetona y diclorometano. Todos ellos fueron de grado HPLC y suministrados por Labscan (Stillorgan, Co., Dublín, Irlanda). El agua empleada para la fase móvil y preparación de soluciones acuosas fue purificada con un sistema Millipore (milli-Q-50 18 mW), ácido fórmico (grado analítico, 98%) fue obtenido de la casa comercial Panreac (Barcelona, España).

Se preparó una disolución patrón de 50 mg/l mezcla de todos los herbicidas y sus metabolitos en acetonitrilo que se almacenó a oscuridad a 4ºC. Esta disolución fue empleada para preparar disoluciones más diluidas para la calibración y para el desarrollo del método. Estas disoluciones se prepararon enrasándose con agua hasta el volumen deseado. En estas condiciones la estabilidad de la solución patrón es aproximadamente de veinte días teniendo lugar a partir de este periodo de tiempo la degradación del fenmedifam.

 

 

Equipos

El desarrollo del método se llevó a cabo mediante un cromatógrafo de líquidos Beckman equipado con dos bombas (System Gold 126 Solvent Module), detector de diodo array (modelo 168) e inyector automático (System Gold 508). Los compuestos se separaron mediante una columna Nova-Pack C-18 (150 x 3.9 mm, 4mm de partícula) suministrado por Waters (Milford, MA, USA).

La extracción en fase sólida se llevo a cabo mediante una estación de procesado de muestras VacMaster® con 10 entradas suministrado por IST (Mid Glamorgan, UK). Para la preconcentración de las muestras se emplearon los siguientes cartuchos Isolute ENV+, empaquetado con un copolimero de estireno-divinilbenceno altamente entrecruzado (500 mg, 6 mL) suministrado por IST (Mid Glamorgan, UK) y con cartuchos C18 (500 mg, 6 mL) suministrado por Supelco (Bellefonte, PA, USA).

Para la obtención de vacio en la estación de procesado de muestras se empleo una bomba de vacio (V-700/710) suministrada por Büchi ( Flawil, Suiza).

 

 

Procedimiento

Los diferentes ensayos que se llevaron a cabo para el desarrollo y optimización del método hasta obtener una recuperación aceptable de los analitos estudiados se describirán en el apartado de resultados y discusión.

Los cartuchos se acondicionaron con 18 mL de CH3CN, 18 mL CH3OH y 18 mL de agua milli-Q. A continuación se procedió a pasar 5 mL con una concentración de 2 ppm de la mezcla de herbicidas y productos de degradación a través del cartucho a gravedad. El cartucho nunca se dejo secar entre la fase de equilibrado y el cargado de la muestra. Posteriormente se secó completamente el cartucho con vacio en un tiempo aproximado de 45 min. La elución de los compuestos se llevó a cabo a gravedad con 3x3 mL (8,2 mL metanol, 800 ?L de agua y 10 ?L de fórmico). Al final de cada elución se aplicó vacio. Por último, se procedió a la evaporación de los analitos eluídos hasta 0,8 mL (mediante una corriente de aire y a temperatura ambiente) y se enrasa a 1 mL con agua milli-Q para su análisis. Todos los experimentos para optimizar el método de extracción en fase sólida se realizaron por duplicado.

Para el análisis cromatográfico se tomaron 450 ?L de muestra y se inyectaron por duplicado en el sistema cromatográfico. El flujo en todos los casos fue de 1 mL/min. La fase móvil fue acetonitrilo/agua (0,1% de ácido fórmico) y la longitud de onda empleada fue la máxima obtenida para cada compuesto (Tabla 2). La concentración de los herbicidas fue calculada por comparación del área de los picos con aquellas obtenidas de las soluciones estándar. La calibración externa se realizó inyectando las soluciones estándar de concentración conocida en el cromatógrafo de líquidos en las mismas condiciones.

 

 

Resultados y discusión

Con el fin de desarrollar un método analítico para la determinación de los herbicidas y sus productos de degradación, en primer lugar se estudiaron diferentes fases móviles que permitiera conseguir una separación de los compuestos objeto de estudio.

Las fases móviles empleadas fueron;

a) agua acidificada con H3PO4 (0,5%)/ acetonitrilo.

b) agua acidificada con H3PO4 (0,5%)+ HCOOH (0,1%)/ acetonitrilo.

c) agua acidificada con HCOOH (0,1%)/ acetonitrilo con HCOOH (0,1%).

d) agua acidificada con HCOOH (0,1%)/ acetonitrilo.

Con las fases móviles a) b) y c) no fue posible la separación de los herbicidas y metabolitos debido a la coelución de varios de ellos. Finalmente, la fase móvil con la que se logró la separación adecuada de los analitos fue d) agua acidificada con HCOOH (0,1%)/ acetonitrilo.

Asimismo, debido a la elución de 2-aminofenol muy cerca del frente cromatográfico se probaron distintas columnas con el fin de obtener mayores tiempos de retención. Las columnas cromatográficas empleadas fueron: Ace 3 AQ (150 x 4.6 mm, 3 ?m), Ace 5 C18 (150x4.6 mm, 5 ?m), Inertsil ODS-3V (250x4.6 mm, 5 ?m), Ace 3 phehyl (100x2.1 mm, 3?m), XDB-C18 (150x4.6 mm, 5 ?m) y Nova-Pak C-18 (150x3.9 mm, 4 ?m).

La mejor resolución se obtuvo con la columna Nova-Pak C18, (150x3.9 mm, 4 ?m). Con estas condiciones de fase móvil y columna cromatográfica se desarrollo un método con gradiente que se muestra en la Tabla 1.

Para lograr la separación de los compuestos fue necesario el desarrollo de un método con gradiente que permitió el análisis de los analitos en 32 minutos.

La Figura 2 muestra un cromatograma de una solución estándar de 2 mg/L de los seis analitos obtenido con estas condiciones con detector UVDAD (ë = 194).

Los tiempos de retención y las longitudes de onda máximas obtenidas para cada compuesto y empleadas para la posterior cuantificación de los analitos se recogen en la Tabla 2.

Se obtuvo una buena linealidad de la respuesta del método cromatográfico en el rango de concentraciones estudiado (0.05 - 5 ppm), con un coeficiente de regresión entre 0.9955 y 0.9999 (Tabla 2).

A continuación, se optimizó el procedimiento de extracción en fase sólida, que en un posterior trabajo será aplicado para la cuantificación de los compuestos al nivel establecido por la Unión Europea de 0,1 ?g/L.

Para ello, estudiamos la capacidad de retención de los compuestos en dos fases sólidas disponibles comercialmente; el primer absorbente fue la fase sólida C-18 que consiste en una cadena hidrocarbonada hidrófoba enlazada a una base de sílice y que es una de las más empleadas por su alta recuperación y selectividad. Como segundo adsorbente seleccionamos un copolimero hidroxilado de poliestireno-divinilbenceno (Isolute ENV+) que posee un área de mayor superficie y que está indicada para la extracción de compuestos polares que no pueden ser retenidos por la fase C-18.

Como disolventes de elución se estudiaron los siguientes disolventes; acetonitrilo, metanol, diclorometano, acetona y acetato de etilo. El volumen de elución elegido para optimizar el disolvente fue 4x3 mL. Para realizar estos experimentos se pasaron 5 ml de agua milli-Q fortificada con los 6 compuestos a estudiar con una concentración de 2 mg/l.

El paso de la muestra se realizó a gravedad, se secó el cartucho y se eluyó con los disolventes citados anteriormente. A continuación se evaporó a sequedad el eluido mediante una corriente de aire y a temperatura ambiente. La reconstitución de la muestra se realizó disolviendo el precipitado en 1 ml de la mezcla acetonitrilo/agua milli-Q (1:10).

Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 3. Como se puede observar el herbicida metamitron y su producto de degradación metamitron desamino presentan un comportamiento muy similar, obteniéndose recuperaciones superiores al 80% en todos los disolventes (excepto diclorometano 65%) cuando se emplea la fase solida C-18.

Por el contrario, con la fase sólida Isolute ENV+ las recuperaciones son prácticamente nulas. En el caso del etofumesato también se obtienen mejores recuperaciones con la fase sólida C-18. Sin embargo, en el caso del fenmedifam y sus metabolitos, 2-aminofenol y toluidina, las recuperaciones en ambas fases sólidas y con todos los disolventes de elución estudiados las recuperaciones son prácticamente nulas.

La alta volatilidad que poseen estos compuestos podría ser la causa de estos resultados, por lo que se realizó un experimento donde en el paso de evaporación del disolvente se probó a evaporar hasta 0.5 mL en vez de llevar a sequedad y posteriormente enrasas hasta 1 mL con agua milli-Q.

En este caso, los disolventes empleados fueron acetona, metanol, acetonitrilo ya que diclorometano y acetato de etilo no pueden ser estudiados debido a su inmiscibilidad con el agua. En la Tabla 4 se muestran los resultados obtenidos en este experimento.

Como se puede observar todos los compuestos tienen una mayor recuperación en la fase sólida C-18 y con respecto a los disolventes de elución el etofumesato se recupera bien con los tres disolventes, el metamitron y metamitron-desamino presentan buena recuperación solamente el metanol y el fenmedifam y sus productos de degradación tienen mejor recuperación con metanol. Por lo tanto, la fase solida seleccionada es C-18 y el eluyente metanol. Sin embargo, a pesar de que el metanol fue el mejor disolvente, no se obtuvieron recuperaciones aceptables para 2-aminofenos y toluidina (42,68% y 39,67% respectivamente).

En el siguiente paso, se optimizaron los volúmenes de elución y en el caso de 3x3 mL se realizó un experimento con una pequeña cantidad de agua con ácido fórmico con el fin de aumentar las recuperaciones. Los resultados de este experimento se muestran en la Tabla 5. Como se puede observar el hecho más destacado es el aumento significativo en la recuperación de 2-aminofenol y toluidina cuando se emplea 3x3 mL de metanol con una pequeña cantidad de ácido fórmico, por lo tanto este es el volumen óptimo para la elución de estos compuestos.

 

 

Conclusiones

Este trabajo se ha centrado en la optimización de un método de extracción en fase sólida y análisis mediante HPLC-DAD de tres herbicidas ampliamente utilizados en Europa en el cultivo de la remolacha azucarera y tres de sus productos de degradación. Se han estudiado dos fases sólidas C-18 e Isolute ENV+ obteniéndose las mejores recuperaciones con la fase sólida C-18. Asimismo, se han estudiado diferentes disolventes y volúmenes de elución, obteniéndose recuperaciones superiores al 70% con 3x3 mL de metanol con una pequeña cantidad de agua con ácido fórmico.

Se ha observado que esta pequeña cantidad de fórmico favorece la desorción de 2-aminofenol y toluidina.

Por otra parte, se ha desarrollado un método cromatografico con gradiente para la separación y cuantificación de los compuestos. Se estudiaron diversas fases móviles y columnas cromatográficas debido a la dificultad del análisis que presentaban los productos de degradación, obteniéndose los mejores resultados con la fase móvil acetonitrilo/agua (0.1% acido fórmico) y columna C-18.

En base a estos resultados, el paso siguiente será el análisis de estos compuestos a los niveles de concentración exigidos por la Unión Europea para los productos fitosanitarios.

 

BIBLIOGRAFÍA

ANÓNIMO. 1998. Directiva 98/83/CE del Consejo de 3 de noviembre de 1998 relativa a la calidad de las aguas destinadas al consumo humano. Diario Oficial nº L 330 de 05/12/1998 pp. 32-54.

BAKER, D.B., BUSHWAY, R.J., ADAMS, S.A. y MACOMBER, C. 1993. Immunoassay screens for alachlor in rural wells: false positives and an alachlor soil metabolite. Environ. Sci. Technol., 27, (3): 562-564.

BALINOVA, A. 1993. Solid-phase extraction followed by high-performance liquid chromatographic analysis for monitoring herbicides in drinking water. J. Chromatogr. A, 643, (1-2): 203-207.

CARABIAS-MARTÍNEZ, R., RODRÍGUEZ-GONZALO, E., FERNÁNDEZ-LAESPADA, M. E., CALVO-SERONERO y L., SÁNCHEZ-SAN ROMÁN F.J. 2003a. Evolution over time of the agricultural

pollution of waters in an área of Salamanca and Zamora (Spain). Water Res., 37, 928-938.

CARABIAS-MARTÍNEZ, R., GARCÍA-HERMIDA, C., RODRÍGUEZ-GONZALO, E., SORIANO-BRAVO, F.E. y HERNÁNDEZ-MÉNDEZ, J. 2003b. Determination of herbicides, including

themally labile phenylureas, by solid-phase microextraction and gas chromatography-mass spectrometry. J. Chromatogr. A, 1002, 1-12.

D?ARCHIVIO, A., FANELLI, M., MAZZEO, P. y RUGGIERI, F. 2007. Comparison of different sorbents for multiresidue solid-phase extraction of 16 pesticides from groundwater coupled with high-performance liquid chromatography. Talanta., 71, 25-30.

EISERT, R., LEVSEN, K. y WUNSCH, G. 1993. Analysis of polar thermally labile pesticides using different solid-phase extraction (SPE) materials with GC and HPLC techniques. Intern. J. Environ. Anal. Chem., 58, 103-120.

KOLPIN, D.W., THURMAN, E.M. y LINHART, S.M. 1998. The environmental occurrence of herbicides: the importance of degradates in groundwater. Arch. Environ. Contam.Toxicol., 35, (3): 385-390.

MAPA. 2007. Anuario de estadística agroalimentario y pesquera.

MOLINA, C., GRASSO, P., BENFENATI, E., y BARCELÓ, D. 1996. Determination and stability of phenmediphan, ethofumesate and fenamiphos in ground water samples using automated solid phase extraction cartridges followed by liquid chromatography high flow pneumatically assisted electrospray mass spectrometry. Intern. J. Environ. Anal. Chem., 65 , 69-82

SABIK, H., JEANNOT, R. y RONDEAU, B. 2000. Multiresidue methods using solid-phase extraction techniques for monitoring priority pesticides, including and degradation products, in ground and surface waters. J. Chromatogr. A, 885, 217-236.

SOMASUNDARAM, L., COATS, J.R., SHANBHAG, V.M. y RACKE K.D. 1991. Mobility of pesticides and their hydrolysis metabolites in soil. Environ. Toxicol. Chem., 10, (2): 185-194.

VANDECASTEELE, K., GAUS, I., DEBREUCK, W. y WALTAEVENS, K. 2000. Identification and quantification of 77 pesticides in groundwater using solid phase coupled to liquid- liquid microextraction and reversed-phase liquid chromatography. Anal. Chem., 72, 3093-3101.

Comprar Revista Phytoma 203 - NOVIEMBRE 2008