Con el objetivo de determinar el mecanismo de acción del producto Inicium se ha estudiado su efecto en el crecimiento en condiciones de invernadero del tomate, en la microbiota y en la inducción de proteínas PR. En la primera fase del estudio del mecanismo de acción se observó la inducción de la expresión de determinadas proteínas PR (pathogenesis-related) como consecuencia del trasplante y en algunos casos de la aplicación del producto. En la segunda fase se estudió el efecto del producto a lo largo del tiempo (cinético) y tanto en plantas trasplantadas como no trasplantadas.
INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS
Existen determinadas sustancias o microorganismos que tienen la capacidad de estimular el desarrollo de las plantas, tanto hortícolas como leñosas. Los mecanismos que intervienen en estos procesos dependen del producto, aunque existen dos vías principales, una indirecta y otra directa. La vía indirecta es a través de un efecto inhibidor sobre la microbiota deletérea (microorganismos patógenos o antagonistas de la planta) que afecta negativamente a su desarrollo en algunas condiciones como por ejemplo el trasplante. La vía directa actúa sobre la planta, a través de una interacción relativamente específica; es el caso de los elicitores de respuesta defensiva (Induced Systemic Resistance ISR, Systemic Acquired Resistance SAR) o de estimulación de otros procesos que intervienen en su desarrollo (Plant Enhancers). En la vía directa se ha demostrado que se activa la transcripción de determinados genes cuyos productos de expresión son enzimas claves en procesos de la planta como la fenilalanina amonio liasa (PAL) que interviene en el control de la vía de los fenilpropanoides (fitoalexinas), y de â-glucanasas o polifenoloxidasas que intervienen en el control de patógenos, y en procesos de desarrollo de la planta. Las proteínas PR se acumulan en las plantas en respuesta a infecciones, lesiones o determinadas sustancias químicas.
El producto Inicium (compuesto de péptidos de bajo peso molecular) favorece la evolución en el tiempo de los estados fenológicos iniciales de distintas plantas hortícolas de gran interés económico como son el tomate y la lechuga, incidiendo de manera significativa en un mayor enraizamiento de las plantas y en menor grado en el crecimiento de la parte aérea. Un aspecto interesante es que el producto presenta una curva dosis-efecto en la que se detecta un comportamiento similar al de fitohormonas o elicitores de las plantas con una inhibición a elevadas concentraciones.
El objetivo del presente estudio es determinar los posibles mecanismos de actuación del producto Inicium y sentar las bases científicas para mejorar su actividad a nivel agronómico. Se ha seleccionado el tomate dado su gran interés agronómico y por que además existe una abundante bibliografía sobre estudios de promoción de crecimiento y técnicas bioquímicas y moleculares que pueden facilitar el estudio.
Material y métodos
Determinación de la dosis óptima - cultivo en sustrato. Se utilizaron semillas de tomate (var. Rio Grande), en el estado fenológico de 3-4 hojas verdaderas se trasplantaron a contenedores con sustrato y se mantuvieron en condiciones de invernadero.
Para la determinación de la dosis óptima de aplicación del producto, se realizaron dos tratamientos por riego con soluciones acuosas del producto, uno en el momento del trasplante con 100 mL y el segundo 7 días post trasplante con 50 mL de la solución. Se evaluaron 6 concentraciones (0, 4, 6, 10, 12 y 18 mL/L). Se comparó Inicium con otros productos comerciales como benzotiadiazol, harpinas y un enraizante aplicados siguiendo las instrucciones del fa bricante. En total se realizaron 9 tratamientos. Se determinó el número de hojas, altura, peso fresco de la parte aérea y del sistema radical. Con el objetivo de evaluar el efecto del producto en la microbiota se determinaron los niveles poblacionales de bacterias, hongos y levaduras en sustrato y raíz. Se pesaron 10 gramos de muestra y se adicionó 90 mL de agua peptonada, las muestras de sustrato se mantuvieron en agitación durante 30 minutos a 100 rpm en agitador orbital, y las muestras de raíz se procesaron con homogenizador de palas (Stomacker) durante 1 minuto. Después de realizar las diluciones correspondientes se sembraron en medio Mueller-Hinton (M-H) para el recuento de bacterias y en medio Saboraud para realizar el recuento de hongos y levaduras. Las placas de M-H se incubaron a 23ºC durante 24 h y las placas de Saboraud a 20ºC durante 2-3 días. El diseño experimental fue aleatorizado y consistió en 3 repeticiones por tratamiento y 9 plantas por repetición en la evaluación de parámetros de crecimiento, y en la evaluación de la microbiota consistió en 3 repeticiones de una mezcla de las 9 plantas de cada repetición. Con la media de los valores de la variable estudiada por repetición se realizó el análisis de la varianza (ANOVA) para cada tratamiento.
Determinación de la dosis óptima - cultivo en lana de roca. Se utilizaron semillas certificadas de tomate (var. Rio Grande), desinfectadas y germinadas en cilindro de lana de roca a 25ºC y humedad elevada, en microbandejas (Grodan© Plugs). Una vez germinadas y en el estado fenológico de dos cotiledones (11 días post siembra) se trasplantaron a taco de lana de roca (7.5x7.5x6.5 Grodan© Delta) con solución nutritiva G-C. Las plantas se mantuvieron en cámara de ambiente controlado.
Para la determinación de la dosis óptima de aplicación del producto en cultivo en lana de roca se evaluaron 5 concentraciones (0, 0.1, 0.5, 1 y 2.5 mL/L). Para descartar el efecto de la microbiota se adicionó un antibacteriano (estreptomicina 30 mg/L) y un antifúngico (econazol 50 mg/L). Los tratamientos se realizaron por riego de la plantas con soluciones acuosas del producto aplicando un único tratamiento en el momento del trasplante con 50 mL de la solución del producto.
Expresión de proteínas relacionadas con patogénesis (PRs). Para determinar la expresión de PRs se procedió a extraer el RNA total de hojas de plantas de tomate (var. Rio Grande) de 2 semanas. La extracción de RNA se realizó siguiendo el protocolo de un Kit comercial (RNeasy Plant Mini Kit, Qiagen).
Después de realizar la extracción de RNA se realizó un tratamiento con DNAsa (Turbo DNA-free, Ambion). La cuantificación de RNA total se realizó con un espectrofotómetro (NanoDrop© ND-1000, NanoDrop Technologies) y se ajustaron las concentraciones en todas las muestras. Para determinar la expresión de PRs se procedió a realizar una RT-PCR, retrotranscripción (RT) del RNA a cDNA (DNA complementario) y posterior reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Se diseñaron los cebadores específicos de las PRs seleccionadas de tomate, cuyas secuencias se obtuvieron del GenBank (Primer Premier v. 5, Premier Biosoft Inter.). El factor de elongación 1-á se utilizó como control ya que se expresa constitutivamente. Los productos de PCR (9?L) se analizaron por electroforesis en gel de agarosa al 1.3% y se tiñeron con bromuro de etidio para su posterior visualización con un transiluminador de UV. Las imágenes se capturaron con el software Image Capture System (DC120, Eastman Kodak Co.) y se procesaron con el software 1D Image Analysis System (Eastman Kodak Co.). Se determinó para cada gel la intensidad de banda, y el valor obtenido se reescaló de 0 a 3 en función del valor de intensidad de banda. Así si no se observó banda se consideró 0, valores inferiores al percentil 25 se consideraron 1, valores entre el percentil 25 y 75 como 2 y valores de intensidad de banda superiores al percentil 75 como 3. Para comparar de manera objetiva los niveles de expresión de cada gen para cada muestra.
Se realizaron un total de tres ensayos. En el primer ensayo se determinó la expresión de los genes PR-1 (función desconocida), PR-2 (glucanasa), PR-3 (quitinasa) y P23 (proteína similar a la taumatina con función antifúngica), 24 horas después del tratamiento con Inicium a dos concentraciones (0.5 y 1 mL/L) y del trasplante a taco de lana de roca. En el segundo ensayo se realizó un seguimiento de la expresión a las 8, 24, 48 y 72 horas después de los tratamientos y del trasplante de los genes PR-2 y PR-3. En el tercer ensayo también se evaluó el efecto del trasplante a las 72 horas después del trasplante y del tratamiento con Inicium a 1 mL/L de PR-2.
Los tratamientos se realizaron por riego de la plantas con soluciones acuosas de 50 mL del producto a la concentración de 0.5 y 1 mL/L aplicando un único tratamiento en el momento del trasplante.
Resultados
Actividad de Inicium en cultivo de tomate en sustrato y en lana de roca.
La dosis óptima de aplicación de Inicium en el ensayo realizado en sustrato fue de 10 mL/L, Figura 1. Se observó que la aplicación del producto a la dosis más elevada (18 mL/L) presentaba un efecto perjudicial para el desarrollo de las plantas, observándose en general un menor crecimiento de éstas. En el cultivo en lana de roca se observaron diferencias moderadamente significativas entre la altura de las plantas tratadas con Inicium y las plantas sin tratar 18 días después del tratamiento.
Se observó un mayor efecto a la dosis de 0.5 mL/L de Inicium. El efecto de los tratamientos fue muy significativo (P=0.0002, R2=0.76) en la variable altura, significativo en el peso fresco de la parte aérea, poco significativo en el peso seco de la parte aérea y no presentó efecto en las variables número de hojas y peso fresco de la raíz, 18 días después de su aplicación (Figura 2). El tratamiento a la dosis óptima de 10 mL/L presentó valores de altura de las plantas similares a los obtenidos en las plantas tratadas con Bion. Por lo tanto, podemos decir que si bien se observaron diferencias significativas entre tratamientos, el efecto del producto Inicium a la dosis óptima en las variables estudiadas fue moderado.
Es importante remarcar que 7 días después del tratamiento en el ensayo en sustrato se observó en la superficie del sustrato de las plantas tratadas con Inicium a elevadas dosis, crecimiento fúngico, sugiriendo un posible efecto estimulador del producto en la microbiota. En consecuencia, se procedió a determinar los niveles poblacionales de bacterias, hongos y levaduras en el sustrato y en la raíz de las plantas, en el punto final del ensayo (18 días post trasplante).
En la Figura 3 se muestran los resultados que se obtuvieron. En general, los niveles poblacionales fueron superiores en la raíz que en el sustrato, con diferencias de 1 a 3 logaritmos en función del tipo de microorganismo y del tratamiento.
También fueron superiores los niveles poblacionales de hongos y levaduras en las plantas tratadas con Inicium. Se observó un efecto muy significativo de los tratamientos en los niveles poblacionales de hongos y levaduras y un menor efecto en los valores poblacionales de bacterias, tanto en el sustrato como en la raíz. Relacionando la dosis de Inicium con los niveles poblacionales de hongos y levaduras se observaron dos tendencias, una relación directa entre las dosis de Inicium de 0 a 10 mL/L en la que se produce un marcado incremento de los niveles poblacionales, y una estabilización de estos niveles a partir de 10 mL/L de Inicium (datos no mostrados).
Estudio de la cinética de inducción de marcadores (PRs) de respuesta defensiva en la planta
No se observó la acumulación de transcritos en el control no tratado ni trasplantado en las distintas PRs, excepto en la PR-1, que se expresó en todos los tratamientos (datos no mostrados). PR-2 descrita como una glucanasa se expresó en todas las plantas trasplantadas y con mayor intensidad en las plantas tratadas con Inicium a 1 mL/L, en la primera repetición mientras que en la segunda repetición se observó únicamente en las plantas tratadas con Inicium a 1 mL/L ya que probablemente en la planta todavía no se había trascrito suficiente cantidad de RNA (PR-2). PR-3 con función quitinasa se expresó claramente en las plantas tratadas con Inicium en ambas concentraciones, mientras que su expresión en los controles no tratados fue muy leve o imperceptible. P-23 se expresó en todas las plantas trasplantadas y no en los controles no tratados no trasplantados, variando la intensidad de su expresión en función del tratamiento en la primera repetición, mientras que en la segunda los niveles de expresión fueron similares. Tanto PR-2, como PR-3 serían buenos marcadores para posteriores estudios con Inicium, ya que su expresión se produce o es más intensa en las plantas tratadas.
En el segundo ensayo, se observó que la cinética de expresión de los genes correspondientes a las dos proteínas fue diferente dependiendo del tratamiento y de la proteína (Figura 4). Así, PR-2, se expresó en todas las plantas tratadas y con mayor intensidad en las plantas tratadas con Inicium a 1 mL/L. Sin embargo, también se expresó en el control no trasplantado ni tratado. PR-3, con función quitinasa, se expresó claramente en las plantas tratadas con Inicium en ambas concentraciones, mientras que su expresión en los controles fue muy leve o imperceptible. La cinética de expresión de PR-3 fue similar con los tratamientos de 0.5 y 1 mL/L de Inicium, con valores elevados de expresión a 8 y 24 horas y menores a 48 y 72 horas.
Tras 72 horas del tratamiento con Inicium se observó la inducción de la expresión de PR-2 únicamente en plantas no trasplantadas (Figura 5). En las plantas trasplantadas, no se observaron diferencias en la expresión de PR-2 entre el control y las plantas tratadas.
Conclusiones
La dosis óptima de aplicación de Inicium en cultivo en sustrato fue de 10 mL/L, con valores de altura de las plantas y de peso fresco superiores al control no tratado y similar a los obtenidos en las plantas tratadas con benzotiadiazol. En el cultivo en lana de roca se observó que el rango de concentraciones de Inicium de desplaza a valores inferiores en comparación con el cultivo en sustrato. La dosis óptima de Inicium se situó entre 0.5 a 1 mL/L.
Existe una relación positiva entre la dosis de Inicium y los niveles poblacionales de la microbiota radical entre las dosis de 0-10mL/L, que coincide con un mayor desarrollo de las plantas en sustrato. A partir de 10 mL/L el incremento de la dosis del producto no modifica los niveles poblacionales de los microorganismos, ni incrementa el desarrollo de las plantas.
Tanto PR-2, como PR-3 serían buenos marcadores para posteriores estudios con Inicium, ya que su expresión se produce o es más intensa en las plantas tratadas con Inicium.
El tiempo óptimo para la detección de proteínas de patogénesis (PRs) se sitúa alrededor de las 24 horas post tratamiento. En plantas no transplantadas se observa una mayor expresión de PR-2 y PR-3 tras el tratamiento con 1 mL/L de Inicium.
El transplante presenta un efecto significativo en la inducción de PR-2 que enmascara el efecto de Inicium.
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