En el presente trabajo se estudia la composición y las propiedades insecticidas y fungicidas del aceite esencial de Pelargonium capitatum.
Se han identificado 23 componentes del aceite esencial siendo linalool, óxido de rosa<cis,trans>, isomentona, citronelol y formato de citronelol los que aparecen en mayor proporción.
Se ha detectado una importante actividad entomotóxica en el aceite esencial frente a Oncopeltus fasciatus a la dosis de 500 ?g/cm2 (100% de mortalidad) y a 100 ?g/cm2 (63.3%). Sin embargo no presenta actividad frente a Ceratitis capitata.
Los componentes del aceite esencial que presentan mayor actividad insecticida frente a O. fasciatus son: óxido de rosa<cis,trans> (97.7%), L-mentona (95.5%), â-pineno (80.0%) y aterpineol (75.5%) a una concentración de 20 ?g/cm3.
Asimismo, el aceite esencial también presenta actividad fungicida con inhibiciones del crecimiento del 77.1% frente a R. necatrix, 75.0% frente a V. dahlieae y 70.1% frente a T. rosum, mostrando actividades moderadas frente a otros 6 hongos. Se han encontrado actividades fungicidas moderadas en algunos componentes del aceite esencial, siendo el valenceno y b-pineno los más activos.
INTRODUCCIÓN
El Pelargonium capitatum es una planta perenne en climas cálidos. En primavera se recolectan las partes verdes, antes de la floración y después en verano y otoño, durante los días secos y cálidos. Hojas comestibles, que ahuyentan mosquitos y larvas perjudiciales a otras plantas siendo también fuente de extracción comercial de esencia para perfumería (BELLIDO, 1998). El aceite esencial, generalmente está formado por geraniol, citronelol, mentol, linalool y otros componentes (DEMARNE et al., 1993); su composición tanto en cantidades como en variedad de componentes, cambia según la especie seleccionada (KULKARNI et al., 1997), de donde provenga la muestra (VILJOEN et al., 1995) o de la técnica de cultivo (RAM et al., 1997). Se emplea en la industria cosmética en lugar de la esencia de Rosas; además presenta un uso medicinal (capacidad antioxidante y analgésica) (DORMAN et al., 1995) y está comercializado por sus propiedades aromaterapeúticas (LIS-BALCHIN et al., 1996). También es conocida su actividad frente a insectos, hongos y bacterias fitopatógenas (LIS-BALCHIN et al., 1998). Este trabajo tiene como objetivo principal la búsqueda de nuevos agentes naturales con propiedades biocidas, eficaces contra diversas plagas de insectos (Oncopeltus fasciatus Dallas y Ceratitis capitata Wiedemann) y 14 hongos fitopatógenos.
Materiales y métodos
Material Vegetal
La planta objeto de estudio fue recolectada en Denia (Alicante, España) a mediados de octubre e inmediatamente se realizaron las extracciones de los aceites esenciales.
Obtención del aceite esencial
Partimos de 100g de planta fresca (hojas y tallos) previamente lavados con agua destilada. Se trituran y se extraen en fase vapor, con diclorometano, durante 6 horas en un aparato Likens-Nickerson. Posteriormente, el extracto orgánico de diclorometano, se seca con sulfato sódico anhidro, se filtra y se concentra. El aceite esencial así obtenido se guarda a -20ºC hasta su posterior utilización en el análisis cromatográfico y en los ensayos biológicos.
Cromatografía de gases-espectrometría de masas
El estudio de la composición del aceite esencial de P. capitatum se llevó a cabo por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS).
Se utilizó un cromatógrafo de gases de la marca Varian modelo Star 3400, en modo "splitless". La columna empleada fue HP, modelo 5 (Cross-linkel 5% phenylmethyl silicone) de 25m*0.2mm, con un espesor de película de 0.52mm.
Gas portador Helio a presión de 0.9kg/cm2 y flujo de 20mL/min. Temperatura del inyector 260ºC, columna a 40ºC durante 5 minutos y programada hasta 280ºC a 3ºC/min.
El espectrómetro de masas es Varian, modelo Satur II. El método de ionización fue por impacto electrónico (70eV), y el detector fue de atrapamiento iónico (ion-trap), a una temperatura de 170ºC y corriente de emisón de 40?A.
La identificación de cada componente se efectuó por comparación de los espectros de masas publicados, índice de Kovats publicados y espectro de masas e índice de Kovats de muestras patrón.
Determinación de la actividad fungicida
La determinación de la actividad fungicida se realizó en el extracto de aceite esencial y en algunos de los componentes identificados en el mismo.
El método utilizado es el descrito por Santamarina y col (2000), que consiste en medir la inhibición del crecimiento fúngico impregnando los diferentes aceites esenciales en discos.
Los hongos utilizados en este ensayo fueron: Fusarium culmorum (ITM 172), Geotrichum candidum (CM 25), Fusarium oxysporum ssp. gladioli (CPVB-423), Fusarium oxysporum ssp. niveum (CPV-B-44), Colletorichum coccodes CPV-B-27) Colletorichum gloesporoides (CECT 2859), Tricothecium roseum (CECT 2410), Alternaria tenuis (CECT 2662), Rosellinia necatrix (CPV-3), Verticillium dahliae (CPV-53), Trichoderma viride (CECT 2423), Phytophthora citrophthora (CECT 2353), Penicillium italicum (CECT 2294) y Aspergillus parasiticus (CECT 2681).
El medio de cultivo utilizado es PDA. La dosis de aceite esencial para el ensayo es de 1mg/disco. Las placas se incubaron a 28ºC, en estufa y la lectura se hizo a los 4 dias, midiendo el halo de inhibición producido. Los resultados se expresan como la media del porcentaje de inhibición del crecimiento, tomando como el 100% el crecimiento del control. Los ensayos se repitieron 3 veces.
Para determinar la actividad fungicida de los componentes identificados en el aceite esencial, la dosis empleada fue de 0.1mg/disco.
Determinación de la actividad entomotóxica sobre Ceratitis Capitata y Oncopeltus fasciatus
Ambas colonias se mantienen en el insectario del Centro de Ecología Química de la Universidad Politécnica de Valencia.
La colonia de O. fasciatus se mantiene a 27 ± 2ºC y 50-60% de humedad relativa, un fotoperiodo de 16 horas de luz y 8 de oscuridad, con una dieta a base de semillas de girasol crudas y trituradas y botes de agua.
La colonia de C. capitata se mantiene en las mismas condiciones de temperatura, humedad relativa y fotoperiodo. Se utiliza una dieta larvaria a base de: Salvado, 200g; sacarosa, 50g; levadura de cerveza, 25g; Nipagin, 2g; HCl, 7.5 mL; agua, 500mL; la dieta para adultos es una mezcla de sacarosa:hidrolizado de proteinas (4-1). La toxicidad frente a Oncopeltus fasciatus se determina mediante ensayos de fumigación (BOWERS et al., 1976).
El aceite esencial se reparte sobre la cara inferior de la tapa de una placa Petri de 5 cm de diámetro y 1cm de altura. La dosis de ensayo es de 1000 ?g/cm3; si la toxicidad es elevada (mortalidad superior al 50%), se ensayan dosis inferiores de 200 y 20 ?g/cm3. En este caso, cuando el número de insectos muertos es inferior al 25% no se ensayan dosis más bajas.
En el ensayo de los componentes identificados en el aceite se utiliza una concentración inicial de 20 ?g/cm3.
Los ensayos se realizan introduciendo 10 ninfas de O. fasciatus de 3º estadio.
Los ensayos control se realizan aplicando a las placas el mismo volumen de acetona que en los ensayos. Las placas selladas se mantienen en las mismas condiciones de humedad, temperatura y fotoperiodo que la colonia. Al cabo de 3 días, las ninfas se pasan a botes de vidrio de 500 cm3 con un vial de agua y dieta de mantenimiento, a base de semillas de girasol trituradas, donde se hace el seguimiento de su desarrollo.
Se realizan tres repeticiones por ensayo y el grado de toxicidad se expresa como media del porcentaje de mortalidad, una vez descontadas las ninfas muertas en los controles, si las hay.
La toxicidad frente a C. capitata se determina por ingestión. El aceite se añade a la dieta (sacarosa: hidrolizado de proteína 4:1) a una concentración de 50mg/g de dieta. Cada tratamiento se realiza sobre 20 adultos (10 macho y 10 hembras) de 2-3 días de edad, las cuales, han permanecido 12 horas en ayunas, para favorecer la ingestión de comida tratada. Las moscas se introducen en una jaula de metacrilato de 10x10x10 cm, con agua y con la comida tratada; después de cuatro días, dicha comida se reemplaza por comida fresca.
La mortalidad se observa, cada 24 horas, durante 10 días. Se efectúan 4 repeticiones, con su correspondiente control. El grado de toxicidad se expresa como la media del porcentaje de mortalidad.
Resultados y discusión
Se ha estudiado la composición del aceite esencial extraído de las hojas y tallos de P. capitatum y se han identificado 23 compuestos (Tabla 1). Siendo Linalool, óxido de rosa<cis-trans>, isomentona, citronelol, formato de citronelol los que aparecen en mayor proporción. Lo que coincide con lo descrito por diversos autores (KAUL et al.,1997; LIS-BALCHIN, 1993; RAJESWARA-RAO et al.,1993).
Los ensayos de actividad insecticida realizados en el aceite esencial por el método de fumigación (Tabla 2), muestran que el aceite esencial de P. capitatum tiene una importante actividad entomotóxica, a la dosis máxima (500?g/cm2), produciendo el 100% de mortalidad y también a dosis de 100?g/cm2, siendo casi nula a dosis de 10?g/cm2 Matsuda et al. (1996), detectaron actividad repelente de este aceite esencial sobre el género de mosquitos, Aedes. Sin embargo no hemos encontrado ninguna referencia que describa actividad entomotóxica en el aceite esencial de P. capitatum, siendo esta la primera vez que se describe.
En cuanto a los ensayos de entomotoxicidad frente a la mosca del mediterráneo se observo que el aceite esencial no es tóxico.
Respecto a la actividad fungicida (Tabla 3) los efectos más destacables se dieron frente a R. necatrix (77.1%), V. dahliae (75.0%), T. roseum (70.1%), P. citrophthora (58.9%) y A. tenuis (57.7%). El aceite esencial de P. capitatum parece comportarse como un fungicida de amplio espectro. Se han encontrado inhibiciones, en mayor o menor grado, en los 14 hongos ensayados, pertenecientes a 11 géneros diferentes. En 7 de ellos se encontraron actividades destacables y otros 5 presentaron efectos fungicidas importantes.
Se ensayó la posible actividad entomotóxica frente a O. fasciatus de algunos de los componentes identificados en el aceite esencial (Tabla 4). La concentración inicial fue de 20?g/cm3. Las actividades insecticidas más destacables se dieron con óxido de rosa <cis-trans> y L-mentona (97.7% y 95.5% respectivamente).
A resaltar son el grado de entomotoxicidad presentado por â-pineno y a b terpineol.
Los componentes que mostraron una actividad elevada se ensayaron de nuevo a una concentración de 10 ?g/cm3. Los resultados obtenidos (Tabla 5) siguen mostrando una destacable toxicidad, cercana al 50%, del óxido de rosa <cis-trans> y L-mentona. En estos compuestos se observó un descenso de la toxicidad proporcional a la disminución de la concentración de ensayo; en cambio, para el â-pineno y á-terpineol se observó un descenso superior de la entomotoxicidad. Respecto a la actividad fungicida se ensayaron los componentes mayoritarios identificados en el aceite esencial y frente a los hongos que fueron susceptibles al aceite esencial (Tabla 6). Las actividades fungicidas más destacables las presentaron: Valenceno frente a P. citrophthora (40%), linalool frente a R. necatrix (25.9%) y b-pineno y á-pineno frente a T. roseum (27.1%) y (26.8%) respectivamente. La L-mentona ha sido el único componente que ha mostrado actividad fungicida sobre los 5 hongos ensayados; aunque su actividad es moderada, esto refleja un amplio campo de acción.
A la vista de los resultados y dadas las actividades fungicidas obtenidas por el aceite esencial de P. capitatum, se podría afirmar que los componentes ensayados, no son los responsables de la elevada actividad mostrada por el aceite esencial. La actividad fungicida puede deberse a componentes minoritarios del aceite que no fueron identificados o, también a posibles sinergias entre componentes que no han sido evaluados en este trabajo.
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