INTRODUCCIÓN
Con el comienzo del estado de las Autonomías a principios de los 80 se inicia la creación de los Laboratorios de Diagnóstico ubicados en las diferentes dependencias que tenia el Ministerio de Agricultura, y transferidas a las Comunidades Autónomas. Algunos de estos centros conocidos como, Estaciones de Avisos Agrícolas, Laboratorios Agrarios, Servicios de Plagas, centros de Investigaciones Agrarias, etc..., ya disponían de material de laboratorio mas o menos básico, microscopio, lupa binocular, centrífuga, autoclave? .No obstante para poder atender al sector agrario cada vez mas exigente en lo referente al ámbito del diagnóstico de plagas y enfermedades, se tuvo que hacer en todos ellos una buena puesta a punto, en cuanto a utillaje y personal técnico preparado.
El diagnóstico en el campo de la patología vegetal comprende determinaciones no siempre fáciles y en muchos casos se requieren técnicas de laboratorio muy especializadas. El esfuerzo que han hecho las Comunidades Autónomas en la puesta a punto de los laboratorios de diagnóstico fitopatológico y del personal que lo atiende ha sido y sigue siendo un importante reto en el campo de la agricultura de nuestro país, sobre todo si fijamos como objetivo principal el cumplimiento cada vez mas exigente, de la legislación, en temas de agricultura, que marca la UE para todos los países que la integran.
Ámbito de actuación
El objetivo básico de los laboratorios fue y sigue siendo la identificación de plagas y enfermedades que afectan a los cultivos así como dar soporte técnico a las distintas actuaciones de las correspondientes Delegaciones y Consejerias de Agricultura de las Comunidades Autónomas, en el campo de la Sanidad Vegetal.
Aunque mayoritariamente las muestras que reciben los laboratorios proceden de los distintos servicios de la propia Consejeria de Agricultura, Oficinas Comarcales, centros de investigación, ATRIAS, Agrupaciones de Defensa Vegetal..., en muchos de ellos se sigue dando soporte técnico a empresas municipales de jardinería, y se atiende incluso a un gran número de consultas de particulares.
Historia de la tecnología en los laboratorios
Poco a poco fue creciendo el abanico de determinaciones que incluía el diagnóstico de patógenos que afectan a los distintos cultivos, poniendo de manifiesto que en muchas ocasiones, una lupa y un microscopio no eran suficientes para alcanzar un diagnóstico riguroso y rápido. No era posible detectar virus ni clasificar bacterias con fiabilidad si no se disponía de un utillaje especializado para tal fin y que ya se venia utilizando rutinariamente en el mundo de la sanidad animal y de la medicina.
Es a partir de la orden del MAPA de 21 de enero del 85 cuando son obligatorias las prospecciones de sharka (PPV, plum pox virus) en viveros de plantas madre de frutales de hueso. Para ello se pone a punto, para patología vegetal, la técnica ELISA. (enzyme-linked immunosorbent assay). Dicha técnica que ya se usaba durante los años 60 para detección de virus en sanidad animal, se adaptó a virus de la patata (Potato leafroll virus) (CLARK and ADAMS 1977), así como para la tristeza de los cítricos (CTV) (BAR 1978), y otros cultivos viendo que se podía usar como técnica rutinaria en laboratorios de diagnóstico y para certificación de material vegetal sano.
El protocolo seguido para las prospecciones en vivero y plantas madre, así como el de los análisis en laboratorio, fue redactado y puesto a punto en 1985 por los componentes del Grupo de Trabajo de Diagnóstico y Prospecciones Fitosanitarias, (Valencia 1984), por encargo de la Subdirección General de Sanidad Vegetal.
A partir de este momento se dejan de lado técnicas de transmisión por injerto de indicadores leñosos y transmisión mecánica a indicadores herbáceos, usados hasta entonces como técnicas rutinarias. Laboratorios como Boheringer, Sanofi, Ingenasa entre otros ponen al mercado anticuerpos que poco a poco irán ampliando para la mayoría de virus descritos, que afectan a los vegetales. Actualmente se dispone de anticuerpos comerciales monoclonales y policlonales para la detección de la mayoría de virus y bacterias patógenos descritos en vegetales.
La fiabilidad y rapidez de los análisis permite una actuación inmediata en los cultivos en los que se detectan plantas positivas de virus, que se traduce en la destrucción del material infectado.
Viendo como crecía el número de muestras de prospección en los viveros, que tenían que ser analizado por personal, a veces, poco especializado, en trabajos de laboratorio, se introduce la técnica de Inmunoimpresión. Se trata de una técnica comercial de detección rápida diseñada para muestras muy numerosas.
Es una técnica con una alta especificidad para detección de virus si se utilizan anticuerpos monoclonales específicos. No requiere ninguna preparación del extracto vegetal que se exprime directamente sobre una membrana de nitrocelulosa. Se impone como método rutinario para el control de virus de laTristeza de los cítricos (CTV) y Bronceado del tomate (TSWV).
Es un método rápido y barato si se compara con otras técnicas serológicas o moleculares.
Otra técnica que se empezó a usar en los años 80 y que aun se utiliza en algún laboratorio de diagnóstico es el análisis cuantitativo y cualitativo mediante cromatografía de gases, de los ácidos grasos de las células bacterianas, comercialmente conocido como Micobial Identification System (MIS). Además del equipo de cromatografía se requiere de un ordenador que cuantifique e identifique los ésteres metilados de los distintos ácidos grasos, almacenados en su biblioteca, y que están presentes en las células bacterianas. Es indispensable trabajar con cultivos bacterianos puros, cosa no siempre fácil de obtener si partimos de material vegetal enfermo y por tanto muchas veces excesivamente deteriorado. El sistema es bastante específico aunque puede presentar algún fallo a nivel de identificación de alguna especie o patovar de bacterias fitoparásitas Con la entrada en vigor del real decreto 2071/1993 relativo a las medidas de protección contra la introducción y difusión en el territorio nacional y de la CEE de organismos nocivos, y la creación del pasaporte fitosanitario, se ponen a punto en los laboratorios de diagnóstico, (año 1994) encargados de los programas de detección y erradicación de patógenos de cuarentena, técnicas como la Imunofluorescencia(IF) que permiten una detección rápida y fiable de patógenos.
Históricamente se venían usando métodos microbiológicos (cultivo en medios artificiales) muy lentos y no siempre se alcanzaba el resultado esperado ya que a medida que el número de unidades formadoras de colonias disminuye en el huésped, se hace mas difícil su cultivo en medios artificiales, aconsejando en estos casos técnicas serológicas de inmunofluorescencia que además tienen la ventaja que detectan infecciones latentes, especialmente usada para bacteriosis de patata.
Últimos avances tecnológicos en los laboratorios
Durante la prospección de virus en viñedo del año 1996 se detectaron los primeros síntomas que hacían sospechar de la infección por fitoplasmas en vides de plantaciones comerciales. Se conocía muy bien cuales eran los síntomas de la enfermedad, desde hacía años, ampliamente distribuida en Francia y otros países europeos. Fue en febrero de 1997 cuando en el Laboratorio de Sanidad Vegetal de Barcelona y con la amenaza de estar delante de una nueva enfermedad de cuarentena en nuestro país (Flavescencia dorada), se empiezan a usar técnicas moleculares para su detección. La Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) oamplificación enzimática in vitro del ADN, es una técnica molecular basada en la multiplicación y amplificación de un fragmento o secuencia del genoma extraído del organismo que se pretende identificar. Es una técnica extraordinariamente sensible y específica. El segmento amplificado resulta visible mediante electroforesis en gel de agarosa o policrilamida mediante métodos colorimétricos o por hibridación (M.M. LÓPEZ, M. CAMBRA 1995).
Son muchas y variadas las técnicas que se ponen a punto en los laboratorios de diagnóstico, basadas en el análisis genético, siempre con el objetivo de conseguir análisis rutinarios rápidos y precisos. La Hibridación molecular permite el análisis rutinario de un número importante de muestras para un mismo patógeno. Se trabaja con el extracto de muestras vegetales sobre una membrana de nylon cargada positivamente y con sondas de secuencias homólogas a la del patógeno que se quiere detectar (GERHARDT, P. 1981). Variaciones en técnicas moleculares son la PCR Cooperativa, que permite la acción simultánea de 4 primeros (OLMOS, A. 2002) y está especialmente diseñada para virus de RNA. Otra variante es la PCR multiplex que permite detectar simultáneamente dianas de DNA y RNA con una sola reacción. Esta técnica se puso a punto a principios del 2000, con el objetivo de detectar la presencia de varios patógenos en una misma muestra de material vegetal, concretamente para 4 virus distintos en la certificación de olivo.
El mercado para la exportación de material vegetal a terceros países, pide análisis que contribuyan a una rápida y fiable detección de los microorganismos en su medio natural. Cada vez mas se requieren técnicas específicas para detecciones cualitativas y cuantitativas de infecciones latentes. Es la PCR atiempo real el futuro inmediato de todo laboratorio de fitopatología que quiera estar al día en el campo del diagnóstico ya sea para la detección inmediata de nuevas enfermedades así como para la certificación de material vegetal sano, aportando resultados de una mayor especificidad y sensibilidad y a su vez reduciendo riesgos de contaminación en la manipulación del material amplificado.
El elevado presupuesto que para muchos laboratorios fitopatológico supone todo este utillaje, no ha de ser un freno para su utilización. Son muchos los centros de investigación, universidades?etc. dispuestos a optimizar el uso de estos aparatos y a los que se puede acudir mediante fórmulas, como los convenios, colaboraciones, e incluso subcontrataciones.
Abiertos al futuro
El uso de técnicas moleculares para la detección y clasificación de organismos de difícil diagnostico, nos abre un mundo nuevo, lleno de sorpresas y contradicciones que contrasta con el trabajo que, durante siglos, se ha llevado a cabo en la taxonomía en el campo de la zoología y la botánica, basado casi exclusivamente en la observación morfológica de las especies mediante microscopía óptica.
Todo ello nos hace reflexionar sobre la visión amplia y abierta que hemos de tener para aceptar cambios impensables, hasta ahora, que nos ayudan en un mayor conocimiento de los microorganismos que nos rodean. A los laboratorios de diagnostico fitopatológico les reconocemos y agradecemos el importante esfuerzo que han llevado a cabo durante estos últimos años, siempre bajo un criterio científico e innovador, y muchas veces en precarias condiciones. La buenísima relación y compañerismo de los miembros del Grupo de Trabajo de Laboratorios de Diagnostico con la ayuda de los Laboratorios de Referencia, han sido el hilo conductor que ha hecho posible la incorporación de todas estas técnicas en el día a día del diagnostico fitopatológico del país.
Comprar Revista Phytoma 199 - MAYO 2008
