Almería es el principal productor español de tomate en invernadero, con una superficie de 8500 ha, una producción de 807.000 t y un valor en la producción de 573 millones de ?. En 2000 fue descrita la presencia del virus del mosaico del pepino dulce (pepino mosaic virus, PepMV) en Europa por Van der Vlugt et al. en Holanda donde se vio por primera vez afectando a cultivos de tomate. En este mismo año también se detectó en distintas zonas productoras de España, incluyendo Roquetas de Mar en Almería, Murcia y Canarias (JORDÁ, 2000). La forma principal de transmisión en los cultivos se realiza por contacto entre las plantas. También se ha descrito un insecto vector, sin referir la especie (JONES et al., 1990).
INTRODUCCIÓN
El virus del mosaico del pepino fue originalmente encontrado en plantas de pepino dulce (Solanum muricatum) en plantaciones de Perú (Jones et al., 1980) aunque su presencia en Europa no se detectó hasta comienzos de 1999, en cultivos de tomate en Holanda (VAN DER VLUGT et al., 2000) y casi simultáneamente en otros países europeos como Alemania (PFEILSLETTER et al., 2000), España (JORDÁ et al., 2000), Inglaterra (MUMFORD et al., 2001), Italia (ROGGERO et al., 2001) y posteriormente en Austria, Bélgica, Francia, Finlandia, Noruega y Ucrania (VERHOEVEN et al., 2003). También ha sido descrito en Canadá y Estados Unidos (FRENCH et al., 2001).
La incidencia de la enfermedad en los cultivos de tomate ha sido muy variable en los distintos países donde se ha descrito la presencia del virus, que parece estar relacionada con las distintas condiciones ambientales ya que los estudios comparativos de la sintomatología en plantas indicadoras y de la secuencia de bases del ácido nucleico de los distintos aislados obtenidos de tomate (homología >99,1%) muestran diferencias menores, lo que además sugiere una procedencia común del virus. Sin embargo, la comparación entre aislados de tomate y el de pepino dulce muestran diferencias en la sintomatología y en la homología de la secuencia nucleotídica (94.1?94.4%) por lo que se ha propuesto su clasificación en dos grupos diferentes (VERHOEVEN et al., 2003).
La sintomatología que muestran las plantas de tomate en una misma zona de cultivo es muy variable, desde un fuerte mosaico y deformación en las hojas y jaspeado de los frutos maduros hasta un ligero filiformismo de los foliolos, atribuyendo esta variabilidad a diferencias en las condiciones ambientales, principalmente luz y temperatura (JORDÁ et al., 2000).
Comportamiento en de PepMV en plantas hospedadoras
Se ha estudiado la sintomatología que muestran distintas especies indicadoras inoculadas con tres aislados de PepMV procedentes de cultivos de tomate afectados en noviembre de 2000 de Cartagena y Mazarrón y otro de Inglaterra. Cada aislado fue inoculado mecánicamente en 10 plantas de cada especie, utilizando un extracto vegetal en tampón fosfato sódico 0,03 M, pH 8, a partir de plantas de tomate previamente infectadas mediante inoculación mecánica con cada aislado y analizadas por DAS-ELISA utilizando un antisuero de la Universidad de Wageningen (Plant Research International).
El aislado de Cartagena se inoculó en toda la gama, mientras que el de Mazarrón y el inglés solo en algunas especies de solanáceas.
Todas las inoculaciones fueron realizadas en enero de 2001, en un invernadero de ambiente semicontrolado con temperaturas entre 15 y 20ºC., luz natural y provisto de malla de 20x20 hilos cm-2 contra la entrada de insectos. Tras un periodo de 50 días todas las plantas se analizaron por DASELISA.
El número de plantas que de cada especie indicadora estaban infectadas se expresa en la Tabla 1.
Durante 70 días se realizó un seguimiento de la evolución de los síntomas observándose que solo D. stramonium, tomate Marmande y berenjena Bonica mostraron síntomas sistémicos. Además, las hojas de las plantas de berenjena manifestaron un fuerte mosaico amarillo-limón acompañado de deformación, durante los 14 meses que se mantuvieron estas plantas, aún cuando fueron podadas 2 veces; mientras que en D. stramonium y tomate los síntomas sistémicos no se apreciaban a partir de mayo, ni en las hojas nuevas ni en los frutos, si bien el virus se detectaba por DAS-ELISA. Ninguna de las especies de cucurbitáceas, leguminosas y chenopodiáceas mostraron síntomas ni dieron resultados positivos en DAS-ELISA.
Los 3 aislados estudiados han tenido un idéntico comportamiento en gama de plantas indicadoras, infectando solo a algunas especies de solanáceas: D. stramonium, tomate, S. demissum A6, pepino dulce (S. muricatum) y berenjena. A nivel experimental la berenjena se ha mostrado como una especie muy idónea para el mantenimiento del virus.
Caracterización molecular del virus
El virus del mosaico del pepino dulce (PepMV) es un miembro del género Potexvirus; su material genético consiste en una molécula RNA con sentido mensajero de 6410 nucleótidos, envuelto por subunidades capsídicas de 26 kDa, generando una partícula flexuosa de 508 nm de longitud y 11 nm de grosor. Una parte del genoma del PepMV de 8 aislados procedentes de Almería y Murcia fue amplificada mediante RT-PCR empleando cebadores específicos (PEPU, 5? AACTTACGAGAATTTGTGCTA 3? y PEPD, 5? ATGGCTCCGTCTTGTGAT 3?) produciendo un amplicon de 506 pares de bases de parte del gen de la proteína de la RNA dependent RNA polymerase (RdRP) de las cepas del virus PepMV Perú y Tomato. Esos amplicons fueron ligados a pGEMT®-easy vector, clonados en Eschericha coli, y secuenciados. Con las secuencias nucleotídicas y su traducciones en amino ácidos obtenidas se realizaron alineamientos múltiples mediante CLUSTAL utilizando los parámetros por defecto.
Se han compararon las secuencias obtenidas de cuatro aislados de Murcia denominados PepMV Murcia (AJ290424), PepMV Aguilas, PepMV Mazarrón1, PepMV Mazarrón2, cuatro aislados de Almería denominados PepMV Roquetas, PepMV El Ejido, PepMV Nijar1 y PepMV Nijar2 y las publicadas en GenBank AF438767 (Francia), AF484251 (España1), AF340024 (Inglaterra), AJ270991(Perú), AJ270992 (Holanda), AJ308445 (España2) y AJ430672 (España3). Los resultados obtenidos se representan en la Figura 2. Los resultados muestran que los aislados de PepMV encontrados en tomate de Almeria pertenecen al mismo ancestro que aquellos encontrados en Perú. Los aislados no se distinguen de otros pertenecientes de la expansión demográfica de PepMV en Europa.
Desarrollo de un método rápido de detección y diagnóstico
Hibridación Molecular
Se sintetizó una sonda RNA a partir de un fragmento de RNA polimerasa dependiente del RNA viral, que fue amplificado a partir de un aislado de Almería (PepMV Nojar1) y clonado en pGEM®-T easy vector, empleando para la amplificación los primeros diseñados, que amplifican un fragmento de 506 pares de bases.
Se han estudiado diferentes procedimientos de aplicación de la muestra:
- Convencional: extracto procedente de la trituración de 0,2 g de material vegetal en 2 ml de tampón citrato, depositando 4 ml sobre la membrana.
- Improntas: cortes transversales y longitudinales de tallos y posterior aplicación del corte a la membrana presionando ligeramente.
- Improntas: aplicación directa mediante el frotamiento de hojas y tallos en la membrana.
- Aplicación directa del jugo procedente de frutos de tomate.
De estos procedimientos, aquellos que utilizan improntas de material vegetal han dado lugar a falsos negativos. Los mejores resultados han sido obtenidos con el método convencional y la aplicación directa del jugo de frutos en las membranas de hibridación.
Estudios comparativos: ELISA-hibridación
Se ha comparado la sensibilidad de detección de PepMV en hojas de tomate, berenjena y datura, mediante DAS-ELISA e hibridación. Diluciones del extracto vegetal: A partir de la concentración habitual de trabajo 1/10 se crearon 10 diluciones más: 1/20, 1/40, 1/80, 1/160, 1/320, 1/640, 1/1280, 1/2560, 1/5120 y 1/10240. De cada dilución se hicieron 3 repeticiones. En la figura X PepMV es detectado en Datura en todas las diluciones, y hasta la dilución 1/2560 en tomate y berenjena.
En las placas ELISA solo se detectó a los 30 minutos de iniciarse la reacción final en todas la diluciones de Datura, pero en tomate y berenjena sólo hasta la dilución 1/250. A los 60 minutos, todas las diluciones fueron detectables (datos no mostrados).
Estudios epidemiológicos de la enfermedad
Se ha estudiado la transmisibilidad de PepMV por la semilla y por el sustrato de cultivo.
Transmisión por semilla
Se obtuvieron las semillas a partir de frutos comerciales de tomate que mostraban síntomas y cuya infección por PepMV fue verificada mediante ELISA.
Los frutos se dejaron madurar sobre papel de filtro en el laboratorio durante 7 días. Las semillas fueron posteriormente separadas de la pulpa, después lavadas con agua y se dejaron secar durante 15 días a temperatura de laboratorio.
Se han realizado dos tipos de estudios, uno sobre las plántulas y otro directamente en las semillas.
Detección en plántulas. 1.677 semillas fueron sembradas en bandejas de semillero con una mezcla de vermiculita y turba esterilizada (1/1 V), en un invernadero de ambiente semicontrolado (17 a 22ºC). Cuando las plántulas tenían entre 8 a 10 hojas verdaderas fueron analizadas, 752 por DAS-ELISA y 925 mediante hibridación molecular.
En ambos casos se tomaron las hojas maduras más cercanas al ápice y se utilizó 0,2 gramos de material vegetal que se homogenizó en 2 ml del correspondiente tampón. Se depositó 150 ml y 4 ml de extracto vegetal en las placas para DAS-ELISA y en las membranas de nylon, respectivamente.
En ninguna de las plántulas analizadas se detecto PepMV, lo que parece indicar que el virus no se transmite por las semillas de tomate o al menos que la tasa de infección estaría por debajo del 0,059%, ya que el virus no ha sido detectado en un total de 1677 semillas estudiadas.
Detección en semillas. Se han realizado mediante RT-PCR cuatro tipos de tratamientos:
a) 220 semillas fueron analizadas, recién extraídas de los frutos
b) Más de 1000 semillas fueron envueltas en papel de filtro y mantenidas en cámara a 25ºC, analizando lotes de 10 semillas cada 15 días.
c) 100 semillas germinadas en laboratorio, colocándolas en placas petri con papel de filtro humedecido con agua esterilizada durante 15 días a temperatura de laboratorio (unos 20ºC)
d) 360 semillas recién extraídas se sometieron a dos tipos de desinfección, 60 semillas con fosfato trisódico al 10% (23 g de Na3PO4.12H2O en 100ml de H2O) y 300 semillas con ClH al 12%, las semillas se agitaron durante 20 minutos en las respectivas soluciones, después se lavaron con agua. Las que se desinfectaron con fosfato trisódico y 100 semillas desinfectadas con ClH fueron analizadas inmediatamente.
Las 200 semillas desinfectadas con ClH restantes fueron analizadas la mitad después de ser germinadas y la otra mitad en el estado de plántulas.
Las semillas que fueron analizadas recién extraídas de los frutos (tratamiento a) dieron resultados positivos en el 32% de los casos, así como en el 36% de las germinadas (tratamiento b). En las semillas que fueron analizadas con una cadencia quincenal (tratamiento c) el virus se detecto hasta el sexto mes. Sin embargo PepMV no se detecto en las semillas o plántulas que fueron tratadas con fosfato trisódico o clorhídrico. Estos resultados parecen indicar que la pulpa que queda adherida a la semilla es la que conserva durante algún tiempo las partículas virales pero que éstas no son viables cuando se deseca o se desnaturaliza con fosfato trisódico o clorhídrico.
Transmisión por sustratos de cultivo
Se dispusieron, en contenedores de 2 litros con una mezcla de vermiculita y turba esterilizada (1/1 V), semillas individualizadas de tomate. Cuando tenían entre 6 a 8 hojas verdaderas se inocularon mecánicamente con el aislado de Mazarrón y transcurrido 1 mes se verificó la infección para lo cual las plantas fueron analizadas mediante hibridación molecular. Todas las plantas fueron cortadas a la altura del hipocotilo y se dispusieron tandas de 10 macetas en las que se transplantaron plantas sanas de tomate con 6 a 8 hojas verdaderas y en otras siembra directa de semillas de tomate, ambos a los 0, 15 y 30 días. Todos los experimentos se realizaron con la variedad Marmande en un invernadero de ambiente semicontrolado (15?20ºC). En cada experimento se contó con 10 plantas de tomate inoculadas mecánicamente como control positivo y otras tantas sin inocular como control sano. Trascurridos 40 días para los tomates transplantados y 70 días para las plantas procedentes de semillas, todas las plantas fueron analizadas mediante hibridación molecular. Ninguna de las 60 plantas mostró síntomas ni fue detectado PepMV.
Por otra parte, se ha realizado el seguimiento de invernaderos afectados en la zona de Roquetas de Mar y bajo Almanzora donde se ha realizado cultivos consecutivos de tomate en suelo y se ha observado que los que estaban infectados en la campaña de 2001 no se infectaron en la siguiente campaña de otoño de 2002.
Ambos resultados parecen indicar, que en las condiciones ambientales de Almería, el sustrato de cultivo no es una fuente de inóculo para nuevas plantaciones que se realicen sobre sustrato que anteriormente haya tenido un cultivo infectado.
Situación y extensión de la enfermedad en Almería
Se han realizado prospecciones en las zonas productoras de tomate durante los cuatro últimos años.
En el primer año solo se visitaron explotaciones alrededor de la zona de Roquetas de Mar donde parece ser que apareció la primera finca afectada (datos sin confirmar). En los últimos tres años se amplió a toda las zonas del Campo de Dalías, Bajo Andarax, Campo de Nijar y la zona del Levante (Cuevas de Almanzora y Pulpi) colindante con Murcia.
En cada invernadero se observó la sintomatología en el 33% de las plantas (1 de cada 3 líneas de cultivo) y se recogieron muestra para su posterior análisis mediante hibridación y DAS-ELISA.
En ninguno de los invernaderos visitados durante los cuatro años se han observado en las plantas síntomas similares a los descritos a PepMV; los síntomas suelen pasar desapercibidos, mostrando las hojas ligero abollonado, distorsión y a veces marchitamiento; si bien en los frutos maduros se apreciaban síntomas atribuibles a este virus.
En las prospecciones de 2000 no se detectó ninguna planta infectada. A partir de 2001 se empezó a detectar el virus en las zonas del Levante, Nijar, bajo Andarax y Roquetas. En 2002 el virus estaba en todas las zonas productoras de Almería, en 2003 además en 3 invernaderos de Granada y en 2004 en Málaga. Los porcentajes de infección se expresan en la Tabla1.
Por otra parte se ha realizado un seguimiento de 8 pequeños supermercados locales del Campo de Dalías y se ha observado que en el 62.5% de los supermercados algunos de los frutos mostraban síntomas atribuibles a PepMV datos que fueron confirmados al ser analizados mediante ELISA con 48,5% de detección en los frutos analizados, tanto en los establecimientos donde los frutos mostraban síntomas como en la mayoría de los que no los mostraban. La procedencia de estos frutos era de diferentes asociaciones de productores.de Murcia y del levante almeriense, lo que podría explicar la introducción de PepMV en otras zonas productoras de Almería.
Además, en el laboratorio de Sanidad Vegetal de Almería se han analizado 851 plantas recibidas de agricultores y técnicos y en las que los síntomas observados no son muy claros en las hojas pero si en los frutos maduros; a veces se observa marchitamiento y colapso de las plantas. Los datos se expresan en la Tabla 2.
A pesar de la cercanía geográfica entre las zonas productoras de tomate de Almería y Murcia, existe una gran diferencia en cuanto a la incidencia de la enfermedad. De hecho, La mayoría de los cultivos afectados en Almería pertenecen a la zona norte de la provincia colindante con las de Murcia y agroclimáticamente parecidas, pero diferentes a las del resto de las zonas productoras de Almería.
Agradecimientos: A Antonia Belmonte Freniche, Ana Ortega Hernández, Luisa Aguilar García, Mª del Mar Martínez Narváez y Mª Dolores Alférez García por la asistencia técnica en campo y laboratorio. Este trabajo ha sido financiado por el proyecto del MCYT AGL200-1651-C03-03 y el Plan de Sanidad Vegetal de la Delegación Provincial de Agricultura y Pesca de Almería, Junta de Andalucía.
BIBLIOGRAFÍA
FRENCH C.J., BOUTHILLIER M., BERNARDY M., FERGUSON G., SABOURIN M., JOHNSON R.C., MASTERS C., GODKIN S., MUMFORD R. (2001). First report of Pepino mosaic virus in Canada and the United States. Plant Disease 85: 1121.
JONES R., KOENING R., LESEMANN D.E. (1980). Pepino Mosaic Virus, a new potexvirus from pepino (Solanum muricatum). Annals of Applied Biology 94: 61-68.
JORDÁ C. (2000). Detectado un nuevo virus que afecta al tomate. Agrícola Vergel 221: 364.
JORDÁ C, LÁZARO A., FONT .I, LACASA A., GUERRERO M.M., CANO A. (2000). Nueva enfermedad en el tomate. PHYTOMA 119: 23-28.
MUMFORD R.A., METCALFE E.J. (2001). The partial sequencing of the genomic RNA of a UK isolate of Pepino mosaic virus and the comparison of the coat protein sequence with other isolates from Europe and Perú. Archives of Virology 146: 2455-2460.
PFEILSLETTER E., LESEMANN D.E., DALCHOW J. (2000). Pepino mosaic virus in der EU ein Quarantänefall? Mitteilungen aus der Biologischen Bundesanstalt für Land und Forstwirtschaft. (52 Deutsche Pflanzenschutztagung in Freising-Weihenstephan) 376: 225.
ROGERO P., MASENGA V., LENZI R., COGHE F., ENA S., WINTER S. (2001). First report of Pepino mosaic virus in tomato in Italy. Plant Pathology 50: 798.
VAN DER VLUGT R., STIJGER C., VERHOEVEN J., LESEMANN D.E. (2000). First Report of Pepino Mosaic Virus on Tomato. Plant Disease 84: 103.
VERHOEVEN J., VAN DER VLUGT R. A., ROENHORST J.W.. (2003). High similarity between tomato isolates of Pepino mosaic virus suggests a common origin. European Journal of Plant Pathology 109: 419-425.
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