El ácido 5-aminolevulínico (ALA) fomentó el crecimiento y producción de distintos cultivos y hortalizas a concentraciones menores de las que causan respuestas elicitoras de los herbicidas; es decir, menos de 1.8 mM en aplicación foliar y 60 ?M en inmersión de las raíces.
Para evaluar la acción fisiológica de ALA, los efectos de ALA en las plantas se estudiaron mediante diversos sistemas de bioensayos a 0.0006-600 ?M. ALA a 0.06-6 ?M en inmersión de la raíz aumentó el crecimiento de los plantones de arroz en condiciones de luz, pero no tuvo efectos en condiciones de oscuridad. En brotes de rábano, el efecto del ALA no era proporcional entre el contenido total de clorofila, la concentración de clorofila y el peso fresco.
En las pruebas con potos, ALA a 0.06 ?M elicitó la acumulación de clorofila, pero la fotosíntesis de las plantas aumentó con un tratamiento conjunto de ALA y nutrientes. Estos resultados indican que ALA causa diversos efectos fisiológicos en la síntesis de clorofila, fotosíntesis y crecimiento de la planta. A baja concentración, ALA actúa como un regulador del crecimiento en la planta. Estos efectos de ALA también se relacionan con la irradiación de luz y la absorción de fertilizante por las plantas. Sin embargo, el exceso de ALA suprimió estos efectos.
El ácido 5-Aminolevulínico (ALA) es un precursor clave para la biosíntesis de las porfirinas, entre las que destaca la clorofila (CHL) y el hierro. Como tal, el tratamiento con ALA de las plantas de mayor tamaño se ha relacionado con la biosíntesis de la Chl y el verdeo de la planta. En las plantas que se trataron con ALA en altas concentraciones ?más de 10 mM-, ALA promueve el verdeo de las plantas etioladas e incrementa la acumulación de varias CHL intermedias, como la protoclorofilida y la protoporfirina IX 1-5. Estas observaciones, estudiadas y conocidas desde hace años, recobran interés gracias a las propiedades herbicidas del ALA6-8. Cuando se expone a la luz plantas verdes, tras un tratamiento en oscuridad de ALA, el exceso de CHL intermedias se fotosensibiliza y las subsecuentes reacciones fotodinámicas dañan las plantas. Se asume que las CHL intermedias acumuladas actúan como fotosensibilizador para la formación de oxígeno singlete, desencadenando el daño por fotodinámica de las plantas tratadas con ALA9-10.
Por otro lado, hemos descubierto recientemente que, aplicado en concentraciones inferiores a las que causan efectos elicitores de herbicidas (menos de 1.8nM en aplicación foliar y 60?M en aplicación directa a la raíz), ALA tiene efectos positivos en el crecimiento y la producción de varios cultivos y hortalizas. La aplicación de las dosis adecuadas de ALA mostraron un 10-60% de efectos promotores en comparación con el control en los cultivos de rábanos, judías, cebada, patata, ajo, arroz y maíz11-12. Asimismo, observamos que la aplicación de ALA a una dosis de 0.18-0.6mM vía foliar incrementa la fijación de CO2 en condiciones de luz y suprime la liberación de CO2 en condiciones de oscuridad12. Sin embargo, los efectos fisiológicos del ALA en las plantas continúan siendo prácticamente desconocidos. El objeto de este estudio es evaluar la acción fisiológica de ALA a bajas concentraciones mediante diversos sistemas de bioensayos.
Materiales y métodos
La influencia de la luz en el crecimiento de plantones de arroz tratados con ALA.
Se esterilizaron semillas de arroz de la variedad Oryza salival.CV. Akinishiki con 200-fold Benlate T diluido (el ingrediente activo es benomilo de Du Pont) para 24h. y se lavó con agua destilada. Estas semillas se cultivaron en un contenedor a 30ºC durante 3 días. Las semillas germinadas se cultivaron en hojas de polietileno expandido canelado con un cutre a 10 semillas por hoja. Estas hojas se dejaron en flotación en platos petri con 150 ml de solución acuosa de ALA a una concentración de 0.06-18?M. Tras el cultivo a 28ºC a un nivel de luz de - 67?mol/m2/s o en condiciones de oscuridad durante 7 días, se midieron las raíces seminales y la elongación coleóptila de cada plantón.
Efectos del ALA en el crecimiento de plantones de arroz. Se sumergieron las raíces de los plantones de arroz (Oryza sativa L. cv. Akinishiki) con un estado foliar de 3.5 en soluciones acuosas de ALA en concentraciones de 0, 0.06, 0.6, 6, 60 y 600?M durante 12h. Estos plantones se transplantaron a macetas de suelo sumergido (1/1000are) a un ratio de 2 plantones en 4 puntos por maceta, y se cultivaron en una profundidad de unos 2 cm en un invernadero (20-30ºC). Tras 18 días, el suelo se eliminó con agua y se midió la longitud y peso seco de cada plantón.
Efectos del ALA en el contenido de clorofila de brotes de rábano. Se plantaron brotes de rábano de 20 gr derivados del rábano en tubos de ensayo (40 mm de diámetro, 150 mm de longitud) en 40 ml de Linsmaier-Skoog medio con 2ppm de ácido acetico 1-naftaleno, 0.02ppm de benzyladenina, 3% de sucrosa y 0.06-60?M de Ala. De este modo, se cultivaron los brotes durante 4 semanas a 25ºC, con un nivel de luz de 16 fotoperiodos en 80?mol/m2/s, cambiándose el medio cada 2 semanas. Se calculó el peso fresco de estos brotes. Éstos (una media de 20gr.) se plantaron en arena de playa y se extrajo la CHL con acetona-agua (85:15).
Se redisolvió la CHL en una fase de etil éter mediante la adición de etil éter a la solución. Tras la deshidratación, se analizó la absorción a 660 y 642.5 nm. El contenido total de CHL se calculó según la fórmula: Cantidad total de CHL (mg/g)=[]Abs.(660)x7.12+Abs.(642.5)x16.5] x ratio de dilución/peso muestra (gr).
Efectos del ALA en la fotosíntesis de la lima photos. Se cortaron hojas de lima pothos (Epipernmum aureus) con un peciolo. Se sumergió la zona de corte en Murashige-Skoog medio (pH 5.5) y se dejaron en una cámara de crecimiento donde comenzaron a formarse las raíces. Las hojas de tamaño uniforme con raíces (planta modelo) se cultivaron en una cámara de crecimiento con agua pura, agua con 0.0006-60?M de ALA, Murashige-Skoog medio sin sucrosa y hormona (MS) y MS con 0.06?M de ALA. Su medio se cambió cada 2 semanas.
Las condiciones de cultivo fueron las siguientes: temp 27ºC, humedad relativa 70%, 12h fotoperiodo nivel de luz de 72?mol/m2/s. En las plantas modelo, se calculó la actividad fotosintética y el contenido de Chl con un anilador de infrarrojos (Li-6200 Li Cor, Inc) y un analizador óptico (SPAD-502 Minolta Camera Co. Ltd) cada dos semanas.
Plantas y químicos: Las plantas obtenidas fueron: rábano (Sakata Co Lts) semillas de arroz, rábano y lima pothos (Nohara Syubyo Co Ltd) Los químicos se compraron: ALA HCI (Wako Chemicals Co Ltd) y Neoesterina ( agente activo de superficie no iónico, Kumiai Chemical Industry Co Ltd)
Resultados y discusión
ALA es un precursor clave para la biosíntesis de porfirinas como la Chl y el hemo (hierro). En la planta, ALA se sintetiza a partir de glutamato en tres fases de reacciones que implica la participación de glutamyl-tRNA intermedio y requiere la participación de ATP y NADPH como cofactores13,14. La biosíntentesis de Chl puede regularse en el momento de formación de ALA15 y la concentración de ALA se mantiene a bajo nivel (menos de 50nmol/g peso fresco) in vivo. Sin embargo, la mayoría de estudios sobre los efectos fisiológicos de Ala se realizaron con aplicaciones de altas concentraciones (p.e 5-40mM, comparado con el nivel in vivo.
El ALA exógeno a altas concentraciones provoca la acumulación de varias Chl intermedias a altos niveles1-5 y las respuestas herbicidas elicitadas en las plantas6-10
Recientemente, descubrimos que Ala tiene efectos promotores del crecimiento y la producción en varios cultivos y hortalizas a concentraciones inferiores a las que causan las respuestas elicitoras de herbicidas, p.e. menos de 1.8mM en aplicación foliar y 60?M en aplicación a la raíz. Las aplicaciones en niveles apropiados de Ala mostraron un 10-60% efectos promotores en comparación con el control en rábanos, judía, cebada, patata, ajo, arroz y maíz11,12.
Asimismo, averiguamos que la aplicación de Ala con 0.18-0.6mM vía foliar incrementaba la fijación de CO2 en oscuridad12. Tanaka et al. Afirman que el tratamiento con 3mM de ALA estimula la acumulación de CHL b y LHCII apoproteínas en los cotiledones de pepino16. Sasaki et at. Demostraron que la adición de 3mM de Ala al medio del cultivo promueve el crecimiento y la actividad fotosintética gracias a la estimulación de CHl y la síntesis de ficocianina en la célula del alga azul-verde Spirulina platensis17. Esta información coincide con los efectos promotores del ALA en el crecimiento y la producción de las plantas. Sin embargo, la acción fisiológica en plantas de ALA en bajas concentraciones sigue sin conocerse bien.
Para estudiar los efectos en el crecimiento de la planta a bajas concentraciones, se aplicó ALA mediante inmersión de las raíces de los plantones de arroz (Figura1) ALA incrementó el peso seco de los plantones de arroz en aplicaciones a la raíz con 0.06-6?M, pero se apreció una pequeña regresión a 60?M. El efecto óptimo se obtuvo con un incremento del peso seco del 14% comparado con el control a una dosis de 0.6?M. Se observó que los efectos de Ala tuvieron mayor repercusión en el peso seco que en la longitud de la planta. Estos resultados mostraron que el tratamiento con Ala no causo un crecimiento espectacular en los plantones. Asimismo, mostraron que el efecto de ALA en la planta depende en gran medida de la concentración de Ala. La aplicación de altas concentraciones causaba una reducción gradual del crecimiento y los plantones mostraban daños aparentes tras el tratamiento con 600?M. La supresión del crecimiento y el daño coincidió con los resultados previos obtenidos a concentraciones más altas. 6,7,18.
En el test de elongación de la raíz seminal de los plantones de arroz bajo irradiación de luz, el tratamiento de ALA a 0.06-0.6?M fomentó la raíz seminal y la elongación coleóptila (Figura 2a). Sin embargo, ALA con más de 6 ?M suprimía el crecimiento de los plantones. Asimismo, las adiciones de ALA en oscuridad inhibían el crecimiento de la raíz seminal y coleóptila (Figura 2b). Estos resultados mostraron que el incremento de crecimiento observado con la utilización de ALA se producía al utilizar una concentración adecuada bajo irradiación de luz. Estos fenómenos resultan muy interesantes si consideramos que ALA es conocido como un precursor de Chl y que su formación se regulaba mediante la luz19,20.
Para calcular el efecto de ALA en la síntesis de Chl, se añadió ALA ?a bajas concentraciones- al medio de cultivo de brotes de rábano. En comparación con el grupo de control y durante todo el ciclo de cultivo, los grupos de brotes con ALA añadido mostraron con claridad un color verde oscuro. El crecimiento y el contenido de Chl de los brotes tras 4 semanas se muestran en la tabla. A dosis de 0.6-60 ?M, ALA promovió el contenido de Chl, pero a 0.06-0.18 ?M no se produjo aumento alguno. Por otro lado, el peso fesco de los brotes incremento con 0.06 ?M de Ala y decreció gradualmente con la aplicación de una dosis mayor de Ala. El contenido total de Chl (concentración x peso fresco) mejoró claramente con la adición de 0.06 ?M de ALA, a pesar de no mejorar la concentración de Chl. Nuestros resultados mostraron que los efectos de la adición de ALA no eran proporcionales entre el contenido total de CLh, la concentración de Chl y el preso fresco. Estos resultados no pueden explicarse por el hecho de que Ala es un precursor de Chl. Se sugirió que, a bajas concentraciones, Ala actuaba como un regulador del crecimiento de la planta y de la biosíntesis de Chl.
La relación entre el contenido de Chl y la fotosíntesis en las plantas tratadas con ALA se analizaron usando plantas modelos inducidas de potos. Los resultados obtenidos usando una solución acuosa de ALA a una concentración de 0-6 ?M se muestran en la Figura 3. El contenido de Chl y la tasa máxima de fotosíntesis (Pmax) en el control (agua) no variaron tras 2 semanas. El contenido de Chl con ALA a 0.0006-0.6 ?M incrementó un 109-115% tras dos semanas en comparación con el valor del control. Así, se consideró que la concentración más adecuada de ALA para este ensayo era 0.06 ?M. Aún así, la Pmax descendió un 80-90% a pesar del incremento de contenido de Chl (Figura 3).
Los potos tratados con 60 ?M de ALA sufrieron daños (datos no mostrados).
Los efectos de Ala en el contenido de Chl no tienen por qué ser idénticos a los efectos de ALA en la actividad fotosintética.
La evolución del contenido de Chl y Pmax en potos se evaluó usando agua pura. MS medio (sin sucrosa ni hormonas) y MS medio (sin sucrosa ni hormonas) con 0.06 ?M de ALA (Figura 4ª, 4b). Con el agua pura (control), el contenido de Chl varió muy poco durante 6 semanas, y la Pmax descendió gradualmente.
Con MS medium (sin sucrosa ni hormonas) con 0.06 ?M de ALA, tanto el contenido de Chl como la Pmax incrementaron gradualmente durante 42 días.
Tras 6 semanas, el contenido de Chl había aumentado un 40% y la Pmax había aumentado un 80% en comparación con el valor inicial. Estos efectos no fueron observados en el MS médium sin ALA. Estos resultados indican que el tratamiento con ALA ?únicamente- estimula la acumulación de Chl en la planta, mientras que el tratamiento de ALA combinado con nutrientes estimula la fotosíntesis en la planta.
En nuestros anteriores trabajos en rábanos, la aplicación foliar de ALA a 0.18-0.6mM incrementó la fijación del CO2 en condiciones de luz12. Estos resultados también se analizaron en cultivo con fertilizante. Los efectos de ALA sobre la fotosíntesis están relacionados directamente con la irradiación de luz y el fertilizante.
Se observó que el ALA estimulaba la actividad del nitrato reductasa en los tejidos de la planta21. Considerando que la tasa de uso de nitrógeno por la planta se rige por el proceso de reducción del nitrato en la planta, los efectos promotores de ALA pueden relacionarse con una mayor absorción de fertilizantes, gracias a la estimulación del ALA.
La supresión de la liberación de CO2 como consecuencia del uso de Ala en rábanos no se ha acabado de comprender. En pepinos, una alta concentración de ALA (20 mM) redujo un 50% la actividad Fotosistema II 10. En preparaciones de Chlorella vulgaris 22,23 y plantas de mayor tamaño24 la síntesis de ALA se inhibe por el hemo, al introducirse en el rango de concentración micromolar. Surge el interés por este hecho, ya que el ALA es también un precursor del hemo, lo que sirve como grupo prostético de encimas respiratorias.
Este estudio demostró que el ALA a bajas concentraciones tiene distintos efectos fisiológicos sobre la fotosíntesis, como el crecimiento de la planta, la síntesis de la clorofila y la fotosíntesis. Una aplicación apropiada de Ala aumenta estos efectos, pero una aplicación excesiva de Ala suprime los citados efectos. Además los efectos promotores del ALA sobre las plantas pueden ser elicitados en condiciones de luz y adición de nutrientes. Sin embargo, aún queda mucho por investigar acerca de los efectos fisiológicos de ALA en las plantas y las posibilidades futuras que ofrece.
BIBLIOGRAFÍA
1 S. GRANICK, Plant Physiol., 34. XVIII (1959).
2 E.C. SISLER AND W.H.KLEIN, Physiol. Plant, 16. 315-322 (1963).
3 C. SUND QUVIST, Physiol. Plant, 22, 147-156 (1969).
4 K. NADLER AND S. GRANICK, Plant Phisiol., 46, 240-246 (1970).
5 P. A. CASTELFRANCO, P. M. RICH, AND S. I. BEALE. Plant Physiol., 53, 615-618 (1974).
6 C. A. REBEIZ, A. MONTAZER-ZOUHOOR, H. J. JOPEN, AND S. M. WU, Enzyme Microb. Technol.,.6. 390-401 (1984).
7 C. A. REBEIZ, K. N. REDDY, U. B. NANDIHALLI, AND J. VELU, Photochem. Photobiol, 52. 1099-1117 (1990).
8 U. KITTSTEINER, A. MOSTOWSKA AND W. REDINGER, Physiol. Plant. 81, 139-147 (1991).
9 Y. ASKIRA. B. RUBIN AND H. D. RAINNOWITH, Free Rad. Res. Commun. 12-13, 837-843 (1991).
10 N. CHAKRABORTY AND B. C. TRIPATHY. Plant Physiol. 98, 7-11 (1992).
11 Y. HOTTA, K. WATANABE, T. TANAKA. Y. TACKEUCHI, AND M. KONNAI. J. Pesticide Sci, 22, 102-107 (1997).
12 Y. HOTTA, T. TANAKA, H. TAKAOBA, Y TAKEUCHI, AND M. KONNAI. Plant Growth Regul, 22, 109-114 (1997).
13 G. C. KANNANGARA. S. P. GOUGH. J. K. HOOBER. A. KAHN. AND D. VON WETTSTEIN, Trends Biochem. Sci, 13. 139-143 (1988).
14 S. I. BEALE. Plant Physiol, 93, 1273-1279 (1990).
15 S. I. BEALE AND P. A. CASTELFRANCO, Plant Physiol, 53. 291-296 (1974).
16 Y. TANAKA. A. TANAKA, AND H. TSUJI, Plant Physiol. Biochem, 30, 365-370 (1992).
17 K. SASAKI. F. J. MARQUEZ, N. NISHIO, AND S. NAGAI, J. Ferment. Bioeng. 79, 453-457 (1995).
18 N. G. AVERINA AND E. B. YARONSKAYA, Photosynthetica, 25, 27-31 (1991).
19 S. M. MAYER AND S. I. BEALE, Plant Physiol, 94, 1365-1375 (1990).
20 L. L. LLAG, A. M. KUMAR, AND D. SOL, The Plant Cell, 6, 265-275 (1994).
21 S. N. MISHRA AND H. S. SRIVASTAVA, Experientia, 39, 1118-1120 (1983).
22 J. D. WEINSTEIN AND S. I. BEALE, Arch. Biochem. Biophys, 237, 454-464 (1985)
23 J. D. WEINSTEIN, R. W. HOWELL, R. D. LEVERETTE, S. Y. GROOMS , P. S. BRINGNOLA, S. M. MAYER, AND S. I. BEALE, Plant Physiol, 101, 657-665 (1993).
24 B. M. CHERESKIN AND P. A. CASTELFRANCO, Plant Physiol, 69, 112-116 (1982).
25 R. A. FLETCHER AND D. MCCULLAGH, Planta, 101. 88-90 (1971).
26 M. DEI, PHYSIOL. Plant, 64, 153-160 (1985).
27 T. MASUDA, R. TANAKA. T. SHIOI, K. TAKAMIYA, C. G. KANNANGARA, AND H. TSUJI. Plant Cell Physiol, 35, 183-188 (1994)
28 T. MASUDA, H. OHTA, Y. SHIOI, H. TSUJI, AND K. TAKAMIYA, Plant Cell Physiol, 36, 1237-1243 (1995).
Comprar Revista Phytoma 193 - NOVIEMBRE 2007
