Los péptidos antimicrobianos son un grupo diverso y abundante de moléculas sintetizadas por la mayoría de los organismos vivos como sistema defensivo. Estos péptidos constituyen una opción eficaz para la mejora genética de plantas en la resistencia a enfermedades debido a la actividad de amplio espectro, la diversidad y la durabilidad del efecto antimicrobiano que presentan. Numerosos estudios demuestran que la expresión transgénica de péptidos antimicrobianos en plantas modelos y en plantas con interés agronómico confiere protección frente a la infección por patógenos.

INTRODUCCIÓN

Los organismos fitopatógenos causan importantes pérdidas en los cultivos y en los productos cosechados, disminuyendo su calidad, destruyéndolos o inutilizándolos. Por ejemplo, pensemos en hongos del tipo Aspergillus productores de toxinas como las aflotoxinas que pueden contaminar muchos productos vegetales reduciendo su calidad cuando son almacenados o procesados en condiciones que favorecen el crecimiento de este tipo de hongos. Actualmente, el control de los fitopatógenos se realiza principalmente con el uso de productos fitosanitarios. Sin embargo, su utilización está cada vez más regulada limitando considerablemente los compuestos efectivos que pueden ser aplicados, debido a los efectos negativos sobre el medio ambiente y la salud humana que presentan muchos de ellos y a que su uso continuado ha llevado al desarrollo de resistencias. La creciente demanda de producción y la limitación del uso de productos químicos, hacen necesaria la búsqueda de nuevas estrategias para el control de enfermedades. La ingeniería genética de plantas, integrada de una manera adecuada con los sistemas de mejora genética tradicionales, representa una aproximación eficaz para la obtención de variedades resistentes a fitopatógenos. Una de las estrategias genéticas posibles para la generación de las plantas resistentes es la expresión de genes que codifiquen péptidos antimicrobianos capaces de destruir o inhibir el crecimiento de hongos y bacterias patógenas. A continuación se presentarán las características de los péptidos antimicrobianos que los convierten en candidatos idóneos para la mejora genética de plantas y se citarán algunos ejemplos representativos de los resultados obtenidos mediante su expresión en transgenia.

 

 

Péptidos antimicrobianos: mecanismo de acción

Los péptidos antimicrobianos (AMP, de antimicrobial peptides) constituyen un componente conservado evolutivamente de la inmunidad innata, la primera línea defensiva de los seres vivos. Los AMP han sido identificados en bacterias, hongos, insectos, anfibios, mamíferos y plantas. Su amplia distribución sugiere que desempeñan una función defensiva muy importante y efectiva (ZASLOFF, 2002). La mayoría de los AMP estudiados poseen una actividad antimicrobiana de amplio espectro frente a bacterias, hongos, protozoos e incluso virus encapsidados o células cancerígenas. Esto es debido a que actúan sobre la membrana plasmática cuyo diseño está conservado en un amplio espectro de microorganismos y que difiere al de plantas y animales. De ahí, el enorme interés y potencial de los péptidos antimicrobianos para conferir resistencia de amplio espectro en plantas transgénicas frente a fitopatógenos. Precisamente esta actividad de amplio espectro ha estimulado su estudio y el interés clínico, puesto representan una clase de antibióticos con aplicaciones terapeúticas frente a infecciones causadas por microorganismos resistentes a los antibióticos convencionales.

Atendiendo a su naturaleza bioquímica, se pueden encontrar péptidos antimicrobianos aniónicos y péptidos antimicrobianos catiónicos. El primer grupo es el más pequeño e incluye principalmente a péptidos aislados de mamíferos, como moléculas derivadas de neuropéptidos, péptidos ricos en aspártico y en glutámico, dipéptidos aromáticos o péptidos derivados de proteínas que unen oxígeno (MARSHAL y ARENAS, 2003). El segundo grupo es el más numeroso y el mejor estudiado. Incluye péptidos de menos de 100 residuos, básicos debido a la presencia de múltiples residuos de arginina y lisina, y con una proporción sustancial de residuos hidrofóbicos (>30%). La característica principal de estos péptidos e su capacidad para adoptar una conformación anfipática (GUILIANI y col., 2007). La diversidad de estos péptidos es enorme, con más de 900 representantes descritos actualmente (una lista detallada puede consultarse en http//www.bbcm.univ.trieste.it/~tossi/antimic.html, o en http//aps.unmc.edu/AP/main.php). Atendiendo a su estructura secundaria se han clasificado en: i) péptidos lineales, que adoptan frecuentemente estructuras en ·-hélice tales como las cecropinas de insectos o las magaininas de anfibios; ii) péptidos con estructuras muy compactas formadas por hojas-? antiparalelas estabilizadas por puentes disulfuro, tales como las defensinas encontradas tanto en plantas, insectos o mamíferos; iii) péptidos de estructura extendida con predominio de uno o dos aminoácidos, tales como las indolicidinas de mamíferos o las apidaecinas de abejas; y iv) péptidos cíclicos de bacterias y hongos. Tanto los péptidos lineales como los cíclicos pueden estar unidos a cadenas de ácidos grasos, lipopéptidos, o presentar modificaciones químicas dando lugar a pseudopéptidos.

En la Figura 1 se presenta las secuencias y estructuras de péptidos antimicrobianos catiónicos representativos de los diferentes grupos. Muchos de estos péptidos se sintetizan como precursores que son posteriormente procesados dando lugar a los correspondientes productos activos.

La diana de acción de la mayoría de las AMP estudiadas es la membrana plasmática de un amplio rango de microorganismos, cuya composición es diferente a la de organismos multicelulares como plantas y animales. Las membranas de bacterias y hongos poseen una carga externa negativa debido a la alta densidad de fosfolípidos, en tanto que las de mamíferos y plantas es principalmente neutra, puesto que los lípidos cargados negativamente están segregados hacia el lado citoplasmático. Esta diferencia en la composición de la membrana es el principal determinante de la selectividad de acción de los AMP por los microorganismos (ZASLOFF, 2002). Algunas células cancerosas muestran susceptibilidad a AMP que se atribuye a un mayor contenido de fosfatidilserina en sus membranas plasmáticas que les confiere una mayor carga negativa en comparación con las células normales eucarióticas (GUILANI y col., 2007).

También se ha descrito actividad antiviral para algunos AMP. Estos AMP inhiben la replicación de virus encapsidados, debido a la interacción con envueltas víricas cargadas negativamente y consiguiente lisis de la partícula viral.

Varias técnicas se han usado para estudiar el mecanismo de acción de los péptidos antimicrobianos, poniendo de manifiesto una diversidad de efectos sobre el microorganismo diana (BROGDEN, 2005). Estos estudios indican que los AMPs interaccionan con las membranas plasmáticas a través de fuerzas electrostáticas e hidrofóbicas. Tras la interacción se produce la integración y la translocación al citoplasma en el caso de los péptidos con dianas intracelulares donde ejercen su actividad, o la desestructuración de la membrana plasmática en el caso de los péptidos con actividad permeabilizadora de membrana. Varios modelos explican esta actividad permeabilizadora: el modelo "alfombra" y el modelo "poro-canal". La muerte celular del microorganismo diana se produce mediante diferentes mecanismos: por la fatal despolarización de la membrana plasmática, por la alteración de las funciones de la membrana plasmática, por la activación de hidrolasas de pared celular, por la formación de poros que llevan a la salida del contenido celular o por el daño en dianas intracelulares inhibiendo las síntesis de ácidos nucleicos, de proteínas o actividades enzimáticas. En la Figura 2 se muestra un esquema de los mecanismos de acción propuestos para los péptidos antimicrobianos.

Otro aspecto a considerar para valorar la eficacia de los AMP como agentes antimicrobianos es el desarrollo de resistencias en los patógenos. A diferencia de los antibióticos convenciales, la adaptación del patógeno a los AMP es altamente improbable. Esto es debido a que el mecanismo de acción de los AMP suele ser de tipo general, por lo que resulta más difícil de ser anulado que un mecanismo basado en un reconocimiento específico, en el que una mutación puntual en el receptor o el compuesto antimicrobiano sería suficiente para anular su actividad. Dado que las dianas de acción de los AMP son las membranas plasmáticas, los patógenos tendrían que alterar la composición y/o estructura de la membrana plasmática para resistir la acción de los AMP, una solución muy "costosa" para los microorganismos. La otra opción sería la destrucción de los AMP, pero dado que los organismos multicelulares se defienden de los patógenos sintetizando una bateria de péptidos de diferentes clases estructurales, la destrucción mediante la producción de proteasas difícilmente anularía el efecto de todos ellos (ZASLOFF, 2002).

En resumen, los péptidos antimicrobianos constituyen una opción eficaz para conferir resistencia a enfermedades en plantas transgénicas debido a la actividad de amplio espectro, la diversidad y la durabilidad del efecto antimicrobiano.

 

Plantas transgénicas que expresan péptidos antimicrobianos

Se han realizado numerosos estudios para evaluar la eficacia de la expresión de péptidos antimicrobianos en la protección de plantas transgénicas frente a enfermedades.

El éxito de estas estrategias depende de varios aspectos: la eficacia del AMP usado frente a los patógenos a los que se enfrenta la especie vegetal transformada, la expresión correcta y estable en los tejidos de la planta y la utilización de un promotor apropiado para dirigir su expresión, en niveles adecuados, tejidos de la planta y momentos en los que interesa que actúe el producto del transgen. Además el péptido expresado no debe ser tóxico para las células vegetales, ni tampoco animales en el caso de dedicarse al consumo. A continuación se presentarán algunos ejemplos de la expresión de AMP en plantas transgénicas, para una lista detallada y actualizada se recomienda consultar la revisión publicada por Montesinos (2007).

 

Genes de origen vegetal

En la literatura podemos encontrar ejemplos que describen la expresión de genes que codifican AMP de origen vegetal. Estos estudios revelan una protección parcial, que es efectiva solo frente a un limitado espectro de patógenos. Posiblemente ello es debido a que los patógenos de plantas han co-evolucionado con sus potenciales especies huésped, y desarrollado tolerancia hacia esos péptidos vegetales. También hay que considerar que no se conoce todavía la combinación adecuada, dentro del conjunto de genes que participan en la defensa de la planta, que es efectiva para combatir a cada patógeno. Los mejores resultados se han obtenido con el uso de las defensinas de plantas (MURAD y col. 2007). Las defensinas son un grupo de péptidos básicos, de aproximadamente 4 kDa, ricos en cisteínas, con una estructura muy compacta estabilizada por puentes disulfuro. Además de en plantas, las defensinas se han identificado en muchos otros organismos como insectos y mamíferos. Aunque estructuralmente están muy conservadas, existe una gran divergencia a nivel de secuencia, conservándose solamente los residuos de cisteínas que estabilizan la estructura. Esta variabilidad puede reflejar las diferencias en las actividades biológicas de cada defensina, así como la adaptación de las diferentes especies a sus entornos naturales (ZALOSFF, 2002). Las defensinas son activas frente a un amplio rango de patógenos fúngicos y bacterianos, algunas muestran actividad frente a insectos (MURAD y col. 2007). No se ha demostrado que tengan un efecto tóxico frente a células de plantas ni de mamíferos. Algunas defensinas de plantas poseen actividad inhibidora de enzimas digestivas, otras de la síntesis de proteínas y otras alteran la permeabilidad de la membrana plasmática de microorganismos mediante la formación de poros o de canales iónicos. Debido al amplio rango de acción y a las múltiples funciones mostradas por las defensinas presentan un gran potencial para ser utilizadas en la obtención de plantas transgénicas resistentes a patógenos. De hecho se pueden encontrar varios ejemplos de su efectividad, tales como la expresión de una defensina de rábano en tabaco que confiere protección frente a Alternaria longipes o en plantas de tomate frente a Alternaria solana y la expresión de una defensina de alfalfa en patata que protege frente a Verticillium dahliae. Recientemente, se ha demostrado que la expresión de la defensina de Dalia merckii, DmAMP1, confiere resistencia frente a Phytophthora sp en plantas de papaya (ZHU y col., 2007).

 

Genes de origen no vegetal

Los hongos micoparásitos y/o antagonistas del suelo son frecuentemente utilizados como controladores biológicos (por ejemplo Trichoderma spp.). Estos hongos producen numerosas proteínas con actividad antimicrobiana que son efectivas para combatir a otros hongos o bacterias, pero no a las plantas con las cuales conviven. Estos organismos representan una buena fuente suministradora de genes antimicrobianos aplicables a la transformación de plantas y protección frente a fitopatógenos. Presentaremos un ejemplo concreto con el que nuestro grupo de investigación ha estado trabajando. Este es el caso del hongo del suelo Aspergillus giganteus. Este hongo sintetiza y secreta un péptido de 51 aminoácidos y de naturaleza básica denominado AFP (de AntiFungal Protein) debido a que inhibe el crecimiento de determinados hongos filamentosos, incluidos los hongos fitopatógenos Magnaporthe oryzae, Fusarium spp. Botrytis cinerea y Phytophthora infestans (LACADENA y col. 1995; VILA y col., 2001; MORENO y col. 2003). La AFP presenta una estructura tridimensional muy compacta, estabilizada con cuatro puentes disulfuro, y muy resistente a la degradación por proteinasas, similar a las defensinas y tioninas vegetales. En relación al mecanismo de acción de la AFP, se ha demostrado su capacidad de permeabilizar membranas y de interaccionar con ácidos nucleícos, lo que resulta en la neutralización de sus cargas negativas y condensación del DNA. Muy probablemente, la combinación de ambas propiedades explican la actividad antifúngica de la AFP (MORENO y col., 2006). Aspergillus queda protegido de la acción de la AFP sintetizándola en forma de proteína precursora secretada al medio extracelular donde se procesa hasta su forma activa. Posiblemente, la producción de la AFP forma parte de la defensa de A. giganteus frente a otros microorganismos que puedan competir con él en su propio hábitat, el suelo. La expresión de forma constitutiva o regulada por un promotor inducible del péptido AFP en plantas transgénicas de arroz confiere protección frente al hongo M. oryzae, agente causante de la piriculariosis (COCA y col., 2004; MORENO y col., 2005). En la Figura 3 se muestra una fotografía representativa del fenotipo de resistencia a la infección por M. oryzae de las plantas transgénicas de arroz que expresan la AFP de forma constitutiva.

Los péptidos que participan en la respuesta inmune de los insectos, como las cecropinas, son también candidatos válidos para ser utilizados como transgenes en la mejora genética de plantas. Estos péptidos protegen a los insectos de la acción de los microorganismos que son ingeridos cuando se alimentan de una planta. Las características estructurales de las cecropinas consisten en la presencia de una región N-terminal de ?-hélice, una zona central puente con residuos de glicinas y/o prolinas y una región C-terminal muy hidrofóbica. Estas características son determinantes de su actividad antimicrobiana, proceso dependiente de su interacción con las membranas microbianas, disrupción de su estructura y formación de poros que conducen a la pérdida del contenido citoplasmático y en último término a la muerte de la célula diana. Las cecropinas poseen actividad bactericida y fungicida, pero no afectan a las células animales ni vegetales. Son numerosos los estudios realizados para determinar la eficacia de la expresión de cecropinas en plantas transgénicas con resultados variables dependiendo de la especie vegetal y del compartimento subcelular donde se expresan, debido a que las cecropinas son muy susceptibles a la degradación por proteasas vegetales. Así en nuestro grupo se han obtenido plantas transgénicas de arroz que expresan un gen, con un uso de codones optimizado para su expresión en plantas, que codifica el péptido de la cecropina A de la mariposa Hyalophora cecropia y que muestran resistencia a la piriculariosis. En este trabajo se utilizaron dos genes sintéticos diseñados para la expresión de la cecropina A en el espacio extracelular o su retención en el retículo endoplasmático.

Los resultados obtenidos muestran que la expresión de la cecropina A en el retículo confiere una mejor protección frente a la piriculariosis que la expresión extracelular (COCA y col., 2006).

Un aspecto importante que se desprende de los resultados obtenidos de la utilización de genes de defensa de origen no vegetal que codifican péptidos con actividad antimicrobiana, es que la introducción en plantas de este tipo de genes es capaz de conferir un nivel de protección más elevado y frente a un espectro mucho más amplio de patógenos de lo que se observa con la utilización de genes vegetales como transgenes.

 

Genes sintéticos

Además de los estudios dirigidos a la búsqueda de AMP naturales, se ha trabajado intensamente en el diseño y la síntesis de nuevos péptidos derivados de péptidos naturales, más potentes frente a patógenos, más resistentes a la degradación y no tóxicos frente a células de plantas o mamíferos. Ello ha permitido la identificación de péptidos sintéticos más activos que los péptidos naturales a partir de los cuales fueron diseñados, ampliando el repertorio de genes antimicrobianos potencialmente aplicables a la protección de plantas. Así se han obtenido plantas transgénicas de tabaco que expresan un derivado de la magainina, Myp30, que son más resistentes al ataque del hongo Peronospora tabacina y la bacteria Erwinia carotovora ssp. Carotovora (LI y col., 2001). Las magaininas son péptidos lineales con estructura en ?-hélice aislados originalmente de la piel de la rana africana Xenopus laevis. La modificación introducida en Myp30 elimina sitios sensibles a la acción de proteasas, aumentando la estabilidad del péptido frente a las proteasas extracelulares de plantas. Otro ejemplo es el péptido MsrA1, un péptido híbrido de la fusión de las secuencias Nterminales de la cecropina A y las secuencias C-terminales de la melitina. La melitina es un péptido catiónico de 26 aminoácidos con estructura lineal en ?-hélice aislado del veneno de abejas, que presenta una fuerte actividad hemolítica, además de bactericida, fungicida y antivírica frente a virus de plantas.

El péptido híbrido muestra una menor actividad hemolítica, pero conserva la actividad antimicrobiana. La expresión del péptido MsrA1 en plantas transgénicas de patata confiere protección frente a un amplio espectro de patógenos fúngicos y bacterianos, incluso en los tubérculos de patata almacenados por largos períodos de tiempo. En este trabajo además se demostró que ratones alimentados con tubérculos transgénicos no muestran alteración de su flora intestinal, del peso corporal o de comportamiento (OSUSKY y col., 2000). Finalmente, destacar el uso del péptido antimicrobiano sintético, D4E1 diseñado mediante química combinatorial, de 17 aminoácidos, lineal y resistente a la degradación por proteasas de plantas y fúngicas, en la protección de plantas transgénicas de tabaco frente a un amplio espectro de hongos fitopatógenos (CARY y col., 2000).

 

Conclusiones

Los péptidos antimicrobianos han demostrado ser una herramienta muy útil para la mejora de la resistencia a patógenos en plantas transgénicas. Las estrategias basadas en la expresión de genes de origen no vegetal han resultado más eficaces en la protección. Aunque se han obtenido numerosas plantas transgénicas que expresan AMP y muestran diferentes grados de resistencia a fitopatógenos, ninguna de ellas se ha comercializado aún, debido a las limitaciones regulatorias de la liberación de organismos modificados genéticamente y al rechazo social. Cualquier planta transgénica debe someterse a una evaluación de riesgos sanitarios antes de su comercialización, atendiendo a su contenido nutricional, posible existencia de alérgenos y toxicidad. Resulta particularmente interesante la utilización de las plantas transgénicas como biofactorias de AMP para uso farmacéutico en el control de enfermedades infecciosas en las que bacterias resistentes a los antibióticos convencionales están implicadas, o también para su uso en la agricultura como agentes bactericidas o fungicidas.

 

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