El control eficiente de los virus que afectan a especies cultivadas representa uno de los principales desafíos en el desarrollo de medidas eficaces y sostenibles en sanidad vegetal.
Como complemento a las medidas tradicionales de control de las virosis, se demandan nuevas tecnologías respetuosas con el medio ambiente que, necesariamente, precisan para su desarrollo de un conocimiento básico de los mecanismos de defensa de la planta huésped.
El recientemente descrito silenciamiento génico mediado por RNA constituye un mecanismo natural de defensa antiviral que es activado en presencia de dsRNA, dando lugar a la degradación del RNA viral en un proceso dependiente de homología de secuencia entre el dsRNA inductor y el RNA diana. Este descubrimiento abre la posibilidad de desarrollar nuevas aproximaciones biotecnológicas para introducir inductores de esta respuesta de defensa en la planta y, de esta manera, interferir con la multiplicación y dispersión del agente infeccioso viral.
Problemática actual
Los virus de plantas representan uno de los grupos de patógenos más importantes en la naturaleza, causando graves pérdidas económicas en muchas especies de interés agronómico en todo el mundo. El control de las enfermedades virales presenta grandes dificultades dado que, para la mayoría de las virosis, no se dispone de variedades vegetales con resistencia duradera y estable obtenidas por procedimientos de mejora genética. Además, en alguno de los casos en que esto se ha logrado, las resistencias son sobrepasadas en un corto-medio espacio de tiempo por la aparición de nuevas variantes virales (HULL, 2002). Por tanto, los esfuerzos que se realizan actualmente para el control de las virosis se centran en el estudio de la interacción virus-planta, en concreto los procesos que tienen lugar durante el ciclo biológico de estos patógenos, así como en los mecanismos de defensa desplegados por las plantas ante las infecciones virales. El objetivo final de estos estudios es el control de las enfermedades virales mediante el desarrollo de nuevas estrategias dirigidas a interferir con el proceso de infección viral, potenciando los mecanismos de defensa natural de las plantas. Además, el desarrollo de procedimientos biotecnológicos de control de las enfermedades virales en plantas, que impidan la expansión y los efectos negativos producidos por los virus en las cosechas, paliarían en gran medida el uso masivo de plaguicidas empleados en la actualidad para el control de sus insectos vectores.
Un nuevo mecanismo de regulación génica basado en RNA
En los últimos años se han descrito diversos mecanismos de control de la expresión génica en eucariotas basados en RNA. Estos se basan en la inhibición de la expresión génica en alguna de las distintas etapas del proceso: a nivel transcripcional, de estabilidad del mRNA o de producción de proteína (ZAMORA y HALEY, 2005). Las moléculas efectoras en estos procesos son fragmentos de RNA dúplex de pequeño tamaño, 21-25 nucleótidos (sRNAs o microRNAs) que presentan un alto grado de complementariedad de bases con el gen diana, lo que confiere un elevado grado de especificidad al mecanismo de regulación. Estas moléculas reguladoras se generan en la célula a través de varias actividades enzimáticas a partir de precursores de RNA que presentan un alto grado de estructura secundaria, particularidad que los asemeja a RNAs bicatenarios (dsRNA).
Desde un punto de vista aplicado, se ha utilizado esta maquinaria presente en la célula eucariota para manipular la expresión génica mediante el uso de dsRNA exógeno. Este instrumento dota al investigador de una poderosa herramienta molecular con la que interferir con la función de genes y deducir de esta forma su función biológica. El fenómeno, denominado interferencia por RNA (RNAi) en animales o silenciamiento génico post-transcripcional (PTGS) en plantas, se manifiesta de forma experimental cuando un dsRNA correspondiente a un gen endógeno es introducido en células, produciéndose una inhibición de la expresión fenotípica de ese gen diana de manera específica y altamente efectiva.
Debido a que la maquinaria celular responsable de este fenómeno está conservada evolutivamente en eucariotas, el método ha sido adaptado para el análisis genético en organismos tan diversos como plantas, nemátodos, insectos y mamíferos (VOINNET, 2005).
Aplicación del PTGS al control de los virus de plantas
Desde el punto de vista de la aplicación del fenómeno de PTGS al control de los virus vegetales, el genoma del propio virus, compuesto por RNA en la mayoría de los casos, puede llegar a constituir la molécula diana del proceso de degradación.
Es un hecho ampliamente documentado en la literatura que la introducción en el genoma de la planta de secuencias del patógeno puede inducir fenómenos de PTGS, que se traducen en la degradación del genoma viral y la consecuente resistencia de la planta huésped al patógeno (TENLLADO y DÍAZ-RUIZ, 1999). La generación de la molécula inductora del proceso (dsRNA), a partir de las secuencias transgénicas, comporta distintos mecanismos, según sea la estructura del transgén y su integración en el genoma vegetal, en los que puede estar involucrada una RNA polimerasa dependiente de RNA (RDR) del propio huésped que copia la cadena sencilla del RNA transgénico a banda doble. Una estrategia que se sigue para circunvalar la poco eficiente producción de estructuras dsRNA por la RDR celular y así obtener una mejor inducción de la respuesta, es la de introducir en la planta construcciones que dirijan la expresión de repeticiones invertidas (IR) correspondientes a secuencias virales. De esta manera, se producen en la célula vegetal estructuras de dsRNA de una manera directa, obteniéndose plantas inmunes a virus con cerca de un 100% de eficacia (SMITH et al., 2000).
Además de esta vía transgénica de generación de la molécula inductora de PTGS, la mayoría de virus inducen en las plantas que infectan la formación de dsRNA de naturaleza viral como producto intermediario de su ciclo de replicación.
Incluso, se ha postulado la existencia en el genoma de virus RNA de regiones con un alto grado de complementariedad de bases, con la consiguiente formación potencial de dsRNA. De hecho, en determinadas combinaciones virus/huésped se ha demostrado que durante el ciclo de infección ocurre un fenómeno de PTGS natural, es decir, sin la participación de secuencias transgénicas en el sistema (RATCLIFF et al., 1999). El desencadenamiento de este mecanismo de defensa trae como consecuencia la eliminación paulatina del RNA viral en los tejidos de nueva generación del huésped. Los modelos actuales que intentan explicar el mecanismo de defensa antiviral de las plantas mediado por PTGS coinciden en señalar a la estructura dsRNA viral como el inductor de esta defensa natural en plantas. Esta molécula sería reconocida por la maquinaria celular de PTGS como algo extraño al organismo, desencadenando la degradación de la correspondiente molécula de RNA diana, en este caso el RNA viral.
La existencia de un mecanismo natural de defensa en plantas frente a virus se ha visto avalada por el descubrimiento de distintos productos génicos codificados por un número creciente de virus capaces de suprimir la respuesta de PTGS de la planta (VOINNET et al., 1999). De entre estos supresores de silenciamiento, la proteína multifuncional HC-Pro de potyvirus y la P19 de tombusvirus son las mejor estudiadas. De esta manera, se establece un juego de fuerzas enfrentadas entre el patógeno y la planta. Si el patógeno es capaz de contrarrestar el mecanismo de defensa antiviral, la planta pasará a ser huésped del virus. En cambio, si el virus carece de un supresor de silenciamiento lo suficientemente fuerte para contrarrestar esta defensa, la planta presentará resistencia no huésped. Obviamente, el escenario en las relaciones planta/virus no es tan simplista, y esta recién descrita respuesta de defensa debe de entenderse integrada dentro de otras respuestas de defensa frente a patógenos en plantas.
De hecho, se conoce que el mecanismo de defensa frente a virus basado en silenciamiento génico se yuxtapone, e incluso se interrelaciona, con las rutas de inmunidad innata en plantas frente a patógenos basadas en el reconocimiento de proteínas del patógeno por productos génicos del huésped (ALAMILLO et al., 2006).
Interferencia con la infección viral mediante dsRNA
Desde la perspectiva del control de las enfermedades virales en plantas, y según esta innovadora manera de entender las reacciones de defensa frente a patógenos virales, se nos ofrece la posibilidad de manipular en nuestro beneficio el equilibrio que gobierna las reacciones de compatibilidad/incompatibilidad en el seno de las interacciones planta/virus. Se trataría pues de desarrollar herramientas biotecnológicas que potenciaran las reacciones de defensa natural basadas en silenciamiento génico, con vistas a un control racional y respetuoso con el medio ambiente de las enfermedades virales. En el grupo de Virología Molecular de Plantas del CIB, tradicionalmente hemos centrado nuestros esfuerzos en el diseño de estrategias transgénicas para el control de importantes enfermedades producidas por virus. Una de ellas es la causada por las denominadas razas de tobamovirus que infectan variedades de pimiento portadoras de resistencias frente a las cepas comunes de tobamovirus, introducidas mediante mejora genética clásica a lo largo de los años 70. Como fruto de este trabajo, se ha obtenido en un huésped experimental resistencia basada en silenciamiento génico frente al virus del moteado suave del pimiento (PMMoV), con construcciones que codifican RNAs del propio patógeno con capacidad de formar dsRNA (VARGAS et al., 2004). Sin embargo, su implementación en variedades comerciales de pimiento requiere el desarrollo previo de protocolos que permitan de forma eficiente la regeneración in vitro de esta especie, con vistas a obtener transformantes con el carácter agronómico de interés. De manera análoga, muchos cultivos de importancia económica resultan recalcitrantes a los protocolos de regeneración y/o transformación, lo que limita la utilización de la tecnología de la transgénesis como herramienta para el control de las virosis. Además, el posible impacto ecológico asociado a la liberación de material transgénico con resistencia a virus es tema actual de debate en la sociedad europea.
Para intentar paliar estas limitaciones, en los últimos años hemos iniciado el desarrollo de una nueva aproximación biotecnológica dirigida al control de las virosis que, aun basada en silenciamiento génico, no requiere la transformación genética de plantas. Tomando como referencia la utilización de RNA bicatenario para el silenciamiento de la expresión génica documentado en animales, nos propusimos interferir con la infección viral mediante la administración a plantas de formas dsRNA correspondientes a secuencias virales producidas a partir de una fuente exógena.
En una aproximación inicial, la producción de dsRNA se realizó en base a reacciones de transcripción in vitro a partir de clones cDNAs correspondientes a diversas regiones genómicas virales, para, a continuación, introducir mediante inoculación mecánica estas moléculas conjuntamente con el virus en diversos huéspedes experimentales. De esta forma fue posible interferir de manera eficiente con la infección de tres virus distintos, como son el virus del mosaico de la alfalfa, el virus del grabado del tabaco y PMMoV, que constituyen ejemplos representativos de la diversidad de virus RNA en plantas (TENLLADO y DÍAZ-RUIZ, 2001). La interferencia con la multiplicación viral resultó específica tanto de homología de secuencia entre el virus y el dsRNA inductor, como del carácter bicatenario de la molécula interferente, ya que transcritos de cadena sencilla de polaridad negativa o positiva no redujeron la infectividad del inóculo viral. La mayoría de las plantas no mostraron síntomas de infección local o sistémica a lo largo del desarrollo y tampoco acumularon título de virus detectable mediante técnicas inmunoenzimáticas o de hibridación molecular. El hecho de que el uso de dsRNA interfiriera con la formación de lesiones locales en huéspedes con respuesta hipersensible a uno de los virus usado (PMMoV), indica que la interferencia con la multiplicación viral ocurre en los primeros estadios de la infección, muy probablemente bloqueando la replicación del virus en la célula inicialmente infectada por un efecto degradativo sobre los ácidos nucleicos virales (TENLLADO y DÍAZ-RUIZ, 2001). Estos resultados claramente muestran, dentro de un ámbito experimental, el potencial que la administración exógena de dsRNA presenta como estrategia de potenciación del mecanismo de defensa natural frente a virus en plantas.
El potencial del RNAi en el control de las enfermedades virales
Obviamente la utilización de la estrategia basada en RNAi como herramienta dirigida al control de las virosis en cultivos, requiere el desarrollo de métodos de producción y aplicación del agente interferente (dsRNA) que sean apropiados para su empleo sobre gran número de plantas en condiciones naturales de cultivo. Con vistas a la consecución de este objetivo, hemos establecido un procedimiento simple, rápido y barato de producción de grandes cantidades de dsRNA de origen viral usando un sistema de expresión inducible basado en una cepa de Escherichia coli modificada genéticamente. La cepa HT115(DE3) es utilizada rutinariamente para desencadenar RNAi en el nematodo C. elegans. Esta bacteria es deficiente en la producción de RNasa III, una enzima que degrada dsRNA, lo que resulta en la acumulación de formas bicatenarias de RNA en el interior de la célula procariota. Otra modificación adicional del sistema consiste en que, integrado en su genoma, se halla el gen de la RNA polimerasa del fago T7 que se transcribe a partir de un promotor inducible por isopropil-ß-Dtiogalactopiranósido (IPTG). De esta manera, una vez introducido en la bacteria un plásmido en el que se han clonado las secuencias virales de interés bajo el control del promotor T7, es posible inducir la expresión de dsRNA de origen viral, a través de la adición al medio de cultivo de bajas concentraciones de IPTG y en un intervalo de pocas horas. Utilizando esta tecnología, ha sido posible la producción de una extensa variedad de formas dsRNAs correspondiente a distintas regiones genómicas de diferentes virus, así como virtualmente de cualquier secuencia génica de origen diverso que se ha deseado. Para dar una idea de la masiva producción de dsRNA que se alcanza en el sistema bacteriano, baste decir que el RNA bicatenario llega a acumularse a niveles comparables a los RNAs ribosomales, cantidades que corresponden a un rendimiento homogéneo entre experimentos de aproximadamente 4 ?g/ml de cultivo bacteriano.
La inoculación simultánea de extractos de ácidos nucleicos bacterianos inducidos junto con el virus homólogo resultó en la protección de la mayoría de las plantas tratadas de una manera específica de secuencia, ya que extractos bacterianos portadores de un dsRNA sin homología de secuencia con el virus no presentaron interferencia con la infección viral (TENLLADO et al., 2003). Además, el procedimiento constituye un método práctico y reproducible para producir dsRNA, ya que las células bacterianas pueden ser fácilmente sedimentadas, y sus extractos almacenados y distribuidos sin pérdida de sus propiedades interferentes, incluso a temperatura ambiente, según hemos comprobado en el intercambio de este material con una empresa del sector biotecnológico para la evaluación del procedimiento en campo.
Con idea de responder a las demandas que la utilización de la tecnología RNAi plantearía en el sector fitosanitario, se requiere desarrollar un procedimiento rápido y cómodo de extracción de los productos interferentes, una vez conseguida su producción a gran escala en bacterias. Este procedimiento debería excluir protocolos de purificación de ácidos nucleicos que sean laboriosos y costosos, así como, preferentemente, omitir reactivos tales como el fenol, cuyo manejo presenta una elevada peligrosidad. Esta necesidad nos animó a analizar la actividad interferente sobre la infección viral de preparaciones crudas obtenidas mediante la lisis de sedimentos bacterianos por medio de la prensa de French. Este método físico de ruptura de la pared celular es el que presenta una mejor relación de eficacia de lisis respecto al coste del proceso y además, preserva la integridad del dsRNA acumulado en la bacteria durante el proceso de extracción. Hasta el momento, además de frente a PMMoV, hemos producido y evaluado extractos crudos bacterianos portadores de dsRNAs correspondientes a diversas regiones genómicas del virus de la sharka (PPV), el virus Y de la patata (PVY) y el virus del mosaico amarillo del calabacín (ZYMV). Todos estos virus presentan un importante impacto económico en los cultivos que infectan, por lo que se hace necesario métodos de control alternativos frente a las enfermedades que producen.
Desde la perspectiva del método de aplicación del producto interferente, en el laboratorio hemos usado la pulverización como vía de aplicación de los extractos crudos bacterianos sobre la superficie foliar de diversas especies vegetales, huéspedes experimentales (plantas del género Nicotiana) o naturales (pimiento, calabaza, pepino) de los virus citados. Para asemejar en cierta medida las condiciones del ensayo experimental a las condiciones naturales de infección, la inoculación mecánica con el virus se realizó varios días después de la pulverización con los extractos bacterianos. En los diversos ejemplos antes mencionados, el tratamiento resultó efectivo para inhibir la manifestación de síntomas y la acumulación de virus detectable por técnicas inmunoenzimáticas en la mayoría de las plantas tratadas, aunque la eficacia de la protección varió entre cerca del 80% en huéspedes experimentales y pimiento empleando PMMoV, PPV o PVY, hasta el 60% en el caso de cucurbitáceas con ZYMV. La racionalización del fenómeno se basa en que las moléculas de dsRNA pulverizadas penetran en la célula vegetal junto con las partículas virales, a través de la abrasión que la inoculación mecánica ocasiona en las células epidérmicas de la hoja. Una vez en el interior de la célula, el dsRNA es convertido a siRNAs que guían la degradación específica de secuencia del virus homólogo por la maquinaria de silenciamiento celular (TENLLADO et al., 2004). Todos estos resultados efectuados en condiciones experimentales apoyan la utilización de preparaciones crudas de dsRNA producido en bacterias como estrategia de inducción de mecanismos de defensa frente a virus basados en silenciamiento génico.
Ensayos de campo
El estado de la tecnología RNAi demandaba la realización de experimentos piloto en campo para evaluar la efectividad de esta aproximación biotecnológica en el control de las virosis. En este sentido, nuestro grupo, bajo la tutela de la Oficina de Transferencia de Tecnología del CSIC, ha suscrito una Licencia de Patente con Bio-Oz Biotechnologies Ltd., una compañía interesada en aplicar herramientas biotecnológicas respetuosas con el medio ambiente para el control de las virosis (TENLLADO y DÍAZ-RUIZ, 2004). Fruto de este acuerdo, Bio-Oz está llevando a cabo la evaluación de la tecnología basada en dsRNA en condiciones de invernadero y en campo, como paso previo para el posible desarrollo comercial de esta aplicación biotecnológica. La principal innovación tecnológica que Bio-Oz aporta a esta colaboración es el empleo de maquinaria patentada que permite la aplicación eficiente y a escala agronómica de distintos tipos de vacunas antivirales sobre cultivos. El equipo de aplicación está basado en el bombardeo con micropartículas, utilizando gas comprimido, para inocular las superficies foliares con distintos tipos de soluciones, de manera que se facilita la penetración de estas sustancias a través de la capas externas foliares al interior celular. Este instrumental supone pues, una atractiva vía de aplicación de los extractos bacterianos enriquecidos en dsRNA viral, ya que, por una parte, posibilita una penetración homogénea del preparado en las superficies del cultivo y además, permite aplicaciones repetidas del producto interferente para evaluar las condiciones de tratamiento que redunden en una mejor protección de los cultivos. Esto permitiría soslayar una de las limitaciones actuales de la tecnología RNAi, como es la incapacidad del dsRNA que es introducido localmente en la planta para desencadenar una respuesta antiviral de carácter sistémico en el huésped.
Mediante el procedimiento de bombardeo anteriormente descrito, se analizó la capacidad de extractos bacterianos que contenían los dsRNAs correspondientes al gen HC-Pro de ZYMV para interferir con la infección de su virus homólogo en cultivos de calabacín en invernadero. Se ensayaron aplicaciones únicas o múltiples del agente interferente, realizadas al unísono o sucesivamente a la inoculación viral, con objeto de definir el régimen de tratamiento más efectivo para conseguir protección viral. Cuando el tratamiento consistió en el bombardeo conjunto de ZYMV y HC-Pro dsRNA, el 22% de las plantas crecieron sin síntomas aparentes de infección viral, comparado con el 100% de plantas tratadas con ZYMV más tampón o un dsRNA heterólogo que mostraron síntomas de enfermedad. Más aún, la inoculación conjunta con ZYMV y HC-Pro dsRNA, seguida por el tratamiento con ese dsRNA a 2 y 4 días, consiguió la protección completa del 41% de las plantas en un ensayo realizado en paralelo al anterior (Figura 1). El carácter de fenotipo sano en las plantas tratadas fue verificado hasta la finalización de su ciclo biológico mediante ensayos ELISA realizados a partir de tejidos superiores a los tratados. Estos datos sugieren que aplicaciones sucesivas de dsRNA con posterioridad al bombardeo con ZYMV y dsRNA incrementan la protección respecto a la conferida por una única dosis de dsRNA.
La protección conferida por HC-Pro dsRNA frente a ZYMV también fue patente en las plantas sintomáticas, ya que resultó en una bajada significativa del título viral medido mediante ELISA en hojas superiores a 15 días después de la inoculación.
La gran mayoría de los grupos de virus que infectan plantas son transmitidos en la naturaleza a través de insectos vectores. Por tanto, si la tecnología RNAi pretende su implantación como método de control de las enfermedades virales debería demostrar su capacidad de interferir con la principal vía de diseminación de los virus en el campo, esto es, la transmisión vectorial. Para ello, llevamos a cabo tratamientos de plantas de tomate con los dsRNAs correspondientes al gen CP de PVY, un virus transmitido por pulgones (Myzus persicae). A las 24 hr realizamos sobre las hojas tratadas experimentos de transmisión viral con pulgones, a razón de 10 pulgones por planta mantenidos durante 16 hr, tras lo cual se eliminaron con una solución de Confidur al 0,05%. Los individuos clónicos utilizados en estos ensayos habían sido previamente alimentados durante 10 min en plantas infectadas con PVY tras un periodo de ayuno de 2 hr. En cuatro ensayos espaciados en el tiempo que involucraron a más de 170 plantas, se observó un porcentaje significativo de protección comparado con los grupos control tratados con anterioridad a la inoculación viral con ZYMV dsRNA o con tampón. Así, en uno de estos ensayos se observó que mientras en el grupo de plantas tratadas con el dsRNA protector (PVY dsRNA) un 31% de los individuos no manifestaron síntomas de infección viral confirmado mediante ELISA, tan sólo un 10 y un 12% de las plantas tratadas con el dsRNA control o el tampón no se infectaron. Estos bajos aunque prometedores niveles de protección confirman que es posible interferir con el proceso de transmisión de PVY por pulgones utilizando la tecnología RNAi. Actualmente se intenta mejorar el rendimiento de la protección incrementando la cantidad de dsRNA usada en el tratamiento protector, la presión utilizada en el bombardeo de este sobre la planta o bien a través de aplicaciones sucesivas del agente protector.
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