La aparición de una nueva cepa de Tomato Spotted Wilt Virus (TSWV) que supera la resistencia de pimientos, conferida por el gen dominante Tsw, ha sido una causa de la utilización de productos fitosanitarios ilegales para controlar el vector. Se ha estudiado la incidencia de la nueva cepa RB-TSWV (supera la resistencia en pimiento) respecto a la cepa hasta ahora habitual de Almería (wilt type, WT-TSWV que no supera la resistencia en pimiento). Paralelamente se han realizado estudios de caracterización biológica y genética de aislados virales.
Los datos indican que la nueva cepa está muy extendida en el campo almeriense, puesto que de todos los aislados virales ensayados, el 93,3% corresponde con la cepa RB-TSWV y el 6,7% se comporta como la cepa WT-TSWV. Los estudios biológicos de inoculación en una gama de huéspedes y genéticos realizados a varios aislados no muestran diferencias significativas entre ellos, no pudiendo establecerse otra forma de distinguir las cepas salvo la realización de bioensayos sobre pimientos sensibles y resistentes.
INTRODUCCIÓN
El pimiento es uno de los cultivos hortícolas más importantes en la provincia de Almería, tanto por la superficie en cultivo como por los valores de producción, destinándose ésta mayoritariamente a la exportación. Una de las principales enfermedades que afectan a este cultivo es la producida por el virus Tomato Spotted Wilt Virus (TSWV), también conocido como el virus del bronceado. Los síntomas asociados a este virus en pimiento son variables: clorosis y necrosis de los tejidos en crecimiento, curvatura hacia abajo de las hojas apicales, manchas anulares (habitualmente necróticas y concéntricas), en hojas, tallos y frutos, perdiendo así el valor comercial (BOITEUX et al., 1993.)
El virus es transmitido por distintas especies de trips, principalmente Frankliniella occidentalis, constituyendo una plaga difícil de controlar por productos fitosanitarios debido a la facilidad con que adquiere resistencia a los insecticidas, (BRODSGAARD 1994). Por esto, uno de los factores más efectivos en el control de TSWV ha sido la utilización de pimientos resistentes al virus por medio de la introgresión del gen dominante Tsw que induce una reacción de hipersensibilidad caracterizada por limitar la dispersión del virus, desde el punto de entrada en la planta, (BOITEUX 1995.) En 2004 se describió por primera vez en España, la presencia natural en los cultivos de Almería de una nueva cepa del virus TSWV que superaba la resistencia (resistance-breaking strain, cepa RB) produciendo enfermedad en dichos pimientos resistentes (MARGARIA et al., 2004).
Esta carencia de efectividad de la resistencia a TSWV, junto con la falta de efectividad de los productos fitosanitarios autorizados para el control de su vector, ha podido producir un aumento de la presencia de la nueva cepa en los últimos años, pudiendo ser así una de las causas de que determinados agricultores hayan utilizado productos fitosanitarios no autorizados. Este es el caso del Isofenfos metil, encontrado en determinadas partidas de pimiento exportadas a Alemania, Holanda, Finlandia y Reino Unido que activaron el servicio de aviso rápido de la UE por la presencia de este residuo en los frutos, desencadenando de esta forma tareas de inspección y análisis de diversas explotaciones agrícolas por parte de técnicos de Agricultura.
El objetivo del presente trabajo ha sido la realización de un seguimiento de la incidencia de la cepa salvaje (wilt type, WT-TSWV), hasta ahora la habitual en Almería y que no supera la resistencia en pimiento, y de la cepa RB-TSWV, así como la caracterización biológica y genética de diferentes aislados.
Materiales y métodos
Aislados virales
Los 15 aislados virales (P1 a P14 y T1) se obtuvieron entre los años 2005 y 2006 a partir de muestreos dirigidos a la recolección en diferentes invernaderos comerciales de la provincia de Almería, de pimientos sensibles y resistentes a TSWV, y de tomate sensible, con síntomas atribuibles a este virus (Tabla 1).
Se comprobó la presencia e identidad del virus TSWV por ELISA, RT-PCR y secuenciación de un fragmento del genoma, y la ausencia de otros virus que afectan al cultivo de pimiento, como fueron tobamovirus, CMV, PMoV y PVY.
Caracterización biológica
Estos aislados virales fueron previamente clonados biológicamente en Datura stramonium, Nicotiana tabacum var. Samsum, N. tabacum var. Xanthi y/o N. glutinosa, por medio de al menos dos pases, con el fin de seleccionar un solo aislado viral de cada muestra.
Las inoculaciones se realizaron tanto en invernadero de ambiente controlado (aislados P1, P6, P8, P14 y T1) como en cámara de cultivo (aislados P2, P3, P4, P5, P7, P9, P10, P11, P12 y P13), donde las condiciones eran 25ºC ? 16h día/14ºC ? 8h noche y 85% de humedad relativa.
Todos los aislados fueron inoculados mecánicamente en pimientos sensibles y resistentes, con al menos 5 pimientos de cada variedad y con dos repeticiones de cada inoculación. Adicionalmente, los aislados P2, P4 y P7 se inocularon mecánicamente en una serie de plantas indicadoras que incluían Chenopodium quinoa Willd, Ch. amaranticolor Coste&Reyn, Datura stramonium L., Lactuca sativa L., Lycopersicon esculentum sensible, L.esculentum resistente, Nicotiana benthamiana Domin, N. clevelandii Gray, N. glutinosa L., N. rústica L., N. tabacum L. "Samsum", N. tabacum L. "Xanthi". Las plantas de cada variedad se dispusieron en grupos de tres y se realizó una repetición de la inoculación con cada uno de los aislados.
Los síntomas fueron observados y anotados por un período de un mes, y posteriormente las plantas fueron analizadas por ELISA para la detección del virus.
Caracterización genética
Los diferentes aislados de TSWV, fueron analizados por RT-PCR, amplificando un fragmento de 475pb, perteneciente al gen N, que codifica para la proteína de la nucleocápsida, situado en el segmento RNA S del genoma viral. Los fragmentos amplificados de 11 de los aislados fueron secuenciados y analizados con los programas BioEdit Sequence Alignment Editor y Mega2.
Resultados y discusión
Caracterización biológica
Para la determinación de la cepa RB-TSWV y WT-TSWV se realizaron bioensayos de inoculaciones en pimientos resistentes y sensibles con los distintos aislados.
La identificación de las cepas se obtuvo al comprobar que:
- Todos los pimientos sensibles, inoculados con ambas cepas virales, y los pimientos resistentes inoculados con la cepa RB-TSWV, mostraron lesiones locales cloróticas (Figura 1A), manifestando posteriormente síntomas sistémicos (Figura 1B).
- Los pimientos resistentes inoculados con la cepa viral WT-TSWV mostraron lesiones locales necróticas (Figura 1C) sin infección sistémica.
Los resultados mostraron que 14 de los 15 aislados ensayados corresponden con la cepa RB-TSWV (93,3%), y tan solo el aislado P4, de los 15 aislados ensayados, se corresponde con la cepa WT-TSWV (6,7%) (Tabla 2), lo que nos indica que la nueva cepa está muy extendida en el campo y está desplazando a la cepa WT TSWV.
La caracterización biológica sobre una gama de huéspedes de los aislados P2, P7 (RB-TSWV) y P4 (WT-TSWV), mostró que respecto a pimiento se podían diferenciar los dos patotipos, aunque respecto a síntomas de las plantas indicadoras no se observaron diferencias. Los síntomas sistémicos observados fueron clorosis, deformación, anillos necróticos y necrosis general de la planta. Todas las plantas manifestaron síntomas sistémicos excepto L. esculentum resistente, que mostró lesiones locales necróticas, Ch. amaranticolor (lesiones locales necróticas) y Chenopodium quinoa (lesiones locales cloróticas). Aquellas plantas que manifestaron síntomas sistémicos fueron positivas para TSWV por medio de la técnica ELISA, y aquellas que no mostraron tales síntomas (L. esculentum resistente, Ch. quinoa y Ch. amaranticolor) resultaron negativas. (Tabla 3)
Caracterización genética
De los 15 aislados virales ensayados, a 11 de ellos se les secuenció un fragmento del genoma, al analizarlos no mostraron grandes diferencias nucleotídicas aunque las suficientes como para poder diferenciar 6 haplotipos: Haplotipo 1: Aislados P1, P5, P6, P7 y P8; Haplotipo 2: T1; Haplotipo 3: P2 y P13; Haplotipo 4: P11; Haplotipo 5: P14 y Haplotipo 6: P4. Estos resultados son mostrados en la matriz de identidad nucleotídica, Tabla 4.
La diferencia nucleotídica de la posición 279 de las aislados T1 y P14 produce un cambio en la secuencia de aminoácidos (Isoleucina en vez de Metionina, como en los demás aislados). El resto de las diferencias nucleotídicas observadas, en todos los aislados, son silenciosas, puesto que no producen cambio en la secuencia aminoacídica.
Con los resultados de las secuencias analizadas se realizó un estudio filogenético donde los 6 Haplotipos pueden ser observados (Figura 2).
Estos datos genéticos nos muestran que en la zona del genoma analizada no se distinguen diferencias suficientes como para diferenciar entre los patotipos RB-TSWV y WT-TSWV.
BIBLIOGRAFÍA
BOITEUX L.S. (1995) Allelic relationships between genes for resistance to tomato spotted wilt tospovirus in Capsicum chinense. Theoretical and Applied Genetics, 90:146-149
BOITEUX, L.S.; NAGATA, T.; DUTRA, W.P.; FONSECA, M.E.N. (1993) Sources of resistance to tomato spotted wilt virus (TSWV) in cultivated and wild species of Capsicum. Euphytica, 67:89-94
BRODSGAARD, H.F. (1994) Insecticide resistance in European and African strains of western flower thrips (Thysanoptera: Thripidae) tested in a new residue on glass test. Journal of Economic Entomology, vol. 87, nº 5: 1141-1146
MARGARIA, P.; CIUFFO, M.; TURINA, M. (2004) Resistance breaking strain of Tomato spotted wilt virus (Tospovirus; Bunyariridae) on resistant pepper cultivars in Almería (Spain). Plant Pathology, 53: 795
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