Se evaluó en condiciones in vitro la actividad antifúngica del quitosano sobre el desarrollo de los hongos fitoparásitos Botrytis cinerea y Colletotrichum spp. Se ensayaron cuatro dosis de quitosano (1; 1.5; 2 y 2.5%) que se compararon con los tratamientos control. Las concentraciones de 2 y 2.5% determinaron, en ambas especies, una reducción del diámetro de las colonias significativamente mayor (p<0.05) que las dosis más bajas aunque B. cinerea se mostró más sensible al quitosano que Colletotrichum spp. La concentración que presentó una mayor diferencia entre crecimientos fue la del 2% donde B. cinerea se inhibió en un 57.02% mientras que Colletotrichum spp. lo hizo en un 17.60% menos. La CE50 resultante para B. cinerea fue de 1.77% y la de Colletotrichum spp. de 2.28%.
INTRODUCCIÓN
Botrytis cinerea Pers.:Fr [teleomorfo: Botryotinia fuckeliana (de Bary) Whetzel], el agente causal de la podredumbre gris, infecta más de 200 especies vegetales distintas determinando importantes pérdidas económicas antes y después de la recolección. Este patógeno puede atacar cualquier órgano de la planta y afectar diversos estados de desarrollo del cultivo. Dadas las repercusiones económicas de dicha especie fúngica sobre cultivos de gran interés económico como vid, plantas hortícolas y ornamentales, se han realizado numerosos estudios sobre posibles métodos de control (ELAD y SHTIENBERG, 1995).
Las especies de Colletotrichum spp. son responsables de la enfermedad conocida como antracnosis. Infectan un amplio rango de hospederos durante la etapa pre y postcosecha de diversos productos hortofrutícolas disminuyendo el rendimiento y causando grandes pérdidas a los agricultores. Dicha enfermedad se manifiesta en forma de manchas oscuras, redondeadas u ovaladas, en las que se pueden observar pequeños puntos rosados que corresponden a las estructuras de fructificación del hongo (BAILEY y JEGER, 1992; SUTTON, 1992).
La utilización de fungicidas sintéticos constituye, hasta el momento, el método de control más frecuente de los hongos objeto de estudio, sin embargo, su uso repetido ocasiona problemas de contaminación ambiental y genera la aparición de cepas resistentes que obligan al agricultor a utilizar mayores cantidades de producto fitosanitario, llegando al límite de los rangos permitidos (JOHNSON y col., 1994). Asimismo, GUTIÉRREZ y col. (2006) indicaron que determinadas especies fúngicas causantes de antracnosis dejaron de mostrarse sensibles a los fungicidas más comúnmente utilizados en la producción de tomate.
Dada la dificultad del control químico de las enfermedades de postcosecha de frutos y hortalizas, en los últimos años se ha experimentado en la búsqueda de métodos de control alternativos. Se ha comprobado que el quitosano, un polímero natural, biodegradable, derivado de la quitina, presenta actividad fungicida sobre determinados hongos y juega un papel importante en el establecimiento de barreras mecánicas contra infecciones víricas (WINTEROWD y SANDFORD, 1995). La quitina es el segundo compuesto orgánico más abundante que existe en la naturaleza, después de la celulosa, y es el principal componente de las cutículas de artrópodos como los crustáceos e insectos y de la pared estructural de algunas especies de hongos. Químicamente se trata de un polisacárido formado por N-acetilglucosamina con enlaces ß(1-4); dada su insolubilidad en agua, es necesario modificar su estructura mediante un proceso de desacetilación, que consiste en eliminar los grupos acetilo de su molécula convirtiéndose de esta forma en quitosano soluble (MUZZARELLI, 1977; AIBA y col., 1986; KNORR, 1991). Diversos estudios hacen referencia a la utilización de este producto como forma de prevención de organismos de postcosecha. EL GHAOUTH y col. (1992a y 1992b) demostraron que la aplicación de una película de quitosano en frutos de fresa y tomate reducía las infecciones fúngicas.
El objetivo de este estudio fue evaluar la actividad antifúngica del quitosano en condiciones in vitro sobre el desarrollo de B. cinerea y Colletotrichum spp.
Materiales y métodos
Aislamiento de Botrytis cinerea y Colletotrichum spp.
B. cinerea se aisló a partir de una baya de vid infectada (Vitis vinifera L.) en la que podía visualizarse el desarrollo del micelio y de las estructuras reproductoras (Foto 1). Con ayuda de un pincel estéril se separaron conidios procedentes de un mismo conidióforo que se sembraron en medio de cultivo Patata Dextrosa Agar (PDA, [Sigma, Aldrich, St. Louis, USA] 39g·l-1). Colletotrichum spp. fue aislado de tallos de Dracaena sanderiana Hort., Sander ex Mast. Infectados de forma natural que presentaban los signos típicos de antracnosis (Foto 2 y Foto 3). Pequeños fragmentos del margen de las lesiones fueron desinfectados en una solución de hipoclorito sódico (NaOCl) al 10% durante 5 min. y lavados dos veces consecutivas con agua destilada estéril. A continuación se sembraron en el mismo medio de cultivo anteriormente citado.
Los cultivos puros de ambos hongos se obtuvieron realizando resiembras en cápsulas de Petri a partir de un disco de PDA extraído del margen de las colonias e incubando a 25ºC durante 7 días y con un fotoperíodo de 12 h de luz y 12 h de oscuridad (CABRERA y col., 2004).
Preparación de la solución de quitosano
La solución de quitosano se preparó tratando quitosano comercial, obtenido a partir de caparazones de cangrejo con un 85% de desacetilación (Sigma-Aldrich, St Louis, USA), con HCl 0.25 N. La mezcla se mantuvo en agitación constante a 25ºC durante 2 h. A continuación, se centrifugó a 12.000 r.p.m. durante 5 min con el fin de eliminar el material insoluble y el sobrenadante resultante se precipitó por neutralización con NaOH 1N. Seguidamente se realizaron tres lavados consecutivos con agua destilada estéril, se secó el producto obtenido y se conservó para su posterior utilización (EL GHAOUTH y col., 1991).
La solución de quitosano purificado para ser incorporado al medio de cultivo se preparó disolviendo quitosano neutralizado en HCl 0.25 N y ajustando el pH con NaOH 1N a 5.6.
Valoración de la actividad antifúngica del quitosano
Para evaluar el efecto in vitro de dicha sustancia, al medio de cultivo (PDA) se le añadieron distintas concentraciones de quitosano purificado (1; 1,5; 2; 2,5%) y la mezcla se distribuyó en cápsulas de Petri (15 ml/cáp.) de 90 mm de diámetro.
Una vez solidificado el medio se colocó en el centro de cada cápsula un disco de PDA de 5 mm de diámetro procedente de un cultivo en crecimiento activo de los hongos objeto de estudio. Las cápsulas correspondientes a Colletotrichum spp. se incubaron durante 7 días y las de B. cinerea durante 4 días a 24ºC y con el mismo fotoperíodo antes citado. Se incluyeron como testigos un control con agua destilada estéril y un tratamiento con el mismo volumen de HCl 0.25 N que el utilizado en las distintas concentraciones de quitosano con el fin de comprobar si dicho ácido podía tener algún efecto en el patógeno. Se prepararon un total de 30 cápsulas de Petri por concentración y hongo.
El efecto antifúngico del quitosano se valoró a partir del cálculo del diámetro de las colonias y se estimó la concentración efectiva media (CE50) mediante regresión lineal entre las concentraciones ensayadas y el crecimiento en mm/día para cada uno de los organismos patógenos estudiados. Los resultados se analizaron estadísticamente mediante el análisis de varianza (ANOVA) y las diferencias significativas entre medias del crecimiento radial se determinaron a través del test LSD-Fisher (P?0.05).
Resultados
Los resultados de la actividad antifúngica del quitosano demostraron que tanto B. cinerea como Colletotrichum spp. fueron sensibles a dicho producto. En las Fotos 4 y 5 se aprecia la inhibición progresiva y uniforme del crecimiento miceliar de ambos hongos a medida que aumentan las concentraciones.
Ensayo in vitro para evaluar la inhibición del desarrollo miceliar en B. cinerea
En el Cuadro 1 se aprecia una reducción significativa del crecimiento miceliar (p<0.05) en todas las concentraciones de quitosano ensayadas. Las concentraciones de 2% y 2.5% mostraron el mayor efecto fungicida con un 57.02% y 71.03% de inhibición respecto el control. A concentraciones de 1% y 1.5% la inhibición fue de 26.63% y 41.87% respectivamente. En el Gráfico 1 se representa la recta de regresión obtenida al relacionar el crecimiento medio diario de las colonias con las correspondientes concentraciones de quitosano; se observa que al aumentar la concentración de dicha sustancia se reduce el crecimiento del patógeno, obteniéndose una recta de regresión de Y = -24,321X+ 85,64 con una r2 = 0,9992. La CE50 resultante fue de 1.77 %.
Ensayo in vitro para evaluar la inhibición del desarrollo miceliar en Colletotrichum spp.
En el Cuadro 1 se representa la acción inhibitoria del quitosano sobre Colletotrichum spp. El efecto de dicha sustancia sobre la reducción del desarrollo miceliar de este aislamiento fue estadísticamente significativo (p<0.05). A 2.5% se alcanzó una inhibición del crecimiento del 63.16% comparado con el control, mientras que, a la concentración de 2%, el porcentaje de inhibición fue de 39.42%.
Las dosis de 1% y 1.5% manifestaron una reducción del desarrollo miceliar de 14.96% y 24.95% respectivamente. En el Gráfico 2 se representa la recta de regresión obtenida relacionando el crecimiento en mm/día de las colonias con las respectivas proporciones de quitosano; se comprueba una gradual inhibición del patógeno a medida que aumenta la concentración de dicho producto.
La recta de regresión obtenida fue Y= -12.906X + 56.155 con r2 = 0.9325. La CE50 obtenida para Colletotrichum spp. fue de 2.28%.
La solución del control (con 0.25N HCl a pH 5.6) no ejerció ningún efecto en el crecimiento de los patógenos dado que no se observaron diferencias significativas de crecimiento entre los controles ensayados.
Conclusiones
En este estudio se ha podido determinar que el quitosano presenta actividad fungicida y es directamente responsable de la inhibición de B. cinerea y Colletotrichum spp. Sin embargo, su efecto depende tanto de la concentración utilizada como del organismo patógeno tratado, así las concentraciones de 2 y 2.5% determinaron, en ambos hongos, una reducción del crecimiento miceliar significativamente mayor que las dosis más bajas en ambos hongos y Colletotrichum spp. ofreció más resistencia que B. cinerea a las mismas cantidades de producto ensayado. La mayor diferencia entre crecimientos se presentó en la concentración de 2% donde B. cinerea se inhibió un 57.02% mientras que Colletotrichum lo hizo un 17.60% menos. Diversos estudios demuestran que el quitosano actúa interfiriendo directamente en el crecimiento de los hongos o activando procesos biológicos (EL GHAOUTH y col., 1992a). En los últimos años se ha comprobado que dicha sustancia es un inductor activo de los mecanismos de defensa de las plantas. Se considera que la inducción de resistencia sistémica por parte del quitosano y la expresión de genes que codifican proteínas relacionadas con la patogenicidad (proteínas PR) juegan un papel importante como forma de defensa contra el ataque de un elevado número de hongos y bacterias (BENHAMOU y THERIAULT, 1992; MAUCH y col., 1984).
Nuestros resultados demuestran que esta sustancia puede ser utilizada como forma de control para los hongos B. cinerea y Colletotrichum spp. Según WINTEROWD y SANFORD (1995) no es perjudicial para el hombre y, por tanto, puede representar una alternativa al uso de los productos químicos.
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