Las técnicas actuales de control de los patógenos fúngicos durante la post-cosecha se basan en la utilización de fungicidas de síntesis, cuyo empleo inadecuado ha conducido a la aparición cada vez más frecuente de cepas resistentes. Uno de los mecanismos más habituales de adquisición de resistencia radica en la mutación de ciertos transportadores implicados en eliminar de la célula los compuestos tóxicos o en genes que intervienen en rutas de síntesis de determinados compuestos. La aparición de reglamentos más estrictos respecto a los residuos en los frutos conlleva que una de las principales prioridades de la UE sea velar por la seguridad alimentaria mediante la reducción del empleo de fungitóxicos. Por este motivo, es importante identificar y caracterizar los mecanismos implicados en la aparición de cepas resistentes a los fungicidas más empleados en la post-cosecha.
INTRODUCCIÓN
La calidad de las frutas y hortalizas es primordial a la hora de su comercialización. Esta calidad engloba una serie de parámetros entre los que cabe destacar el aspecto externo, las características organolépticas, presentación, envasado y la vida comercial, que abarca desde el momento en el que el producto sale confeccionado hasta que es consumido por el usuario.
Una de las principales causas que afectan a la calidad de frutas y hortalizas es las enfermedades producidas por microorganismos patógenos de origen fúngico durante la post-cosecha. Las pérdidas económicas ocasionadas por dichas enfermedades representan una gran preocupación para el sector agroalimentario.
A través de los años se han desarrollado diferentes tecnologías enfocadas a controlar o disminuir el desarrollo de microorganismos causantes de enfermedades de post-cosecha, ya sea de forma directa o indirecta. En la actualidad el control de los hongos durante la post-cosecha se realiza mediante el empleo generalizado de fungicidas sintéticos, ya que estos compuestos actúan con rapidez y eficacia (WILLS et al., 1998).
Este método es actualmente el más utilizado, fundamentalmente a causa de su relativo bajo coste y la comodidad en su aplicación. Entre los inconvenientes del uso continuado de los fungicidas, está su limitado espectro de acción y que su aplicación masiva y continuada, en algunos casos de manera poco controlada, ha dado lugar a la aparición de cepas fúngicas resistentes y al mismo tiempo al aumento de residuos pueden resultar perjudiciales para la salud humana y al medio ambiente, en general. Todo ello conlleva numerosas pérdidas, ya que los sistemas de control no resultan efectivos (BUS 1992). Sin embargo, aunque se han propuesto muchos sistemas de control alternativos, ya sean físicos, químicos o biológicos al uso de fungicidas con el fin de evitar su aplicación masiva y continuada, los que se han ensayado hasta la fecha no pueden igualar la efectividad de los fungicidas convencionales cuando se aplican como tratamiento individual.
Tipos de fungicidas
Existe un gran número de compuesto fungicidas, sin embargo los empleados con mayor frecuencia dentro de los fungicidas sistémicos son los bencimidazoles (tiabendazol, benomilo), bifeniles, fenoles (SOPP), y los azoles (imazalil, procloraz).
De todos ellos cabe destacar a los bencimidazoles que inhiben la mitosis y los denominados inhibidores de la demetilación de esteroles o DMIs que actúan inhibiendo la actividad de la citocromo P450 esterol demetilasa (P45014DM), enzima que forma parte de la ruta de biosíntesis de ergosterol. Recientemente se ha incluido dentro de los fungicidas sistémicos a las denominadas estrobilurinas (azoxiestrobin, metil?Kresoxin y trifloxiestrobin). Su modo de acción se basa en la inhibición de la respiración mitocondrial bloqueando la transferencia de electrones entre el citocromo b y el citocromo c1 a nivel del QoI del citocromo b de ahí que también se denominen QoIs (GISI et al. 2000, MA and MICHAILIDES 2005).
Mecanismos de resistencia a fungicidas
La resistencia a compuestos tóxicos es una adaptación genética del hongo a uno o varios fungicidas que conlleva la reducción en la sensibilidad a dichos compuestos.
Este fenómeno que se describe como genotípico o resistencia adquirida se encuentra en numerosos hongos que han sido sensibles al fungicida antes de su exposición al mismo. La resistencia a fungicidas se puede adquirir por mutaciones simples en genes del patógeno o por el incremento de la frecuencia de las subpoblaciones que tienen menor sensibilidad de forma natural. Tenemos que diferenciar entre resistencia e insensibilidad natural o intrínseca de especies que no son sensibles a la acción de estos compuestos. La bibliografía describe la existencia de diferentes mecanismos implicados en la resistencia a DMIs, pero estos mecanismos se pueden generalizar para otros fungicidas (BRENT and HOLLOMON, 1998). En hongos filamentosos se han descrito 4 mecanismos generales
1) La reducción de la concentración intracelular de compuesto antifúngico.
Actualmente, la idea más extendida para explicar la reducción de los niveles de productos tóxicos en la célula se basa en la expulsión activa de estos compuestos gracias a los transportadores ABC (de inglés ATP binding cassette) y los MFS (del inglés Major Facilitator Superfamily) (HAYASHI et al 2002, NAKAUNE et al. 2002).
2) Alteraciones en la diana de unión que provoca una reducción de la afinidad del compuesto fungicida.
Mutaciones puntuales en el gen CYP51 se han asociado con una disminución en la sensibilidad a azoles y se ha descrito para un gran número de patógenos, como Botrytis cinerea, Ustilago maydis, Penicillium italicum, Uncinula necator y Erysiphe gramminis. Igualmente, se han descrito mutaciones puntuales en el gen del citocromo b que dan lugar al cambio G143A o F129L de su correspondiente proteína, confiriendo resistencia a estrobilurinas (MA and MICHAILIDES, 2005) o la sustitución de un aminoácido en la proteína diana b-tubulina que conlleva la aparición de resistencia a bencimidazoles (BARALDI et al. 2003).
3) Sobreexpresión de la diana de unión que ejerce un efecto de titulación del compuesto.
El aumento de P45014DM por la sobre-expresión del gen CYP51, se ha descrito como un mecanismo de resistencia a azoles. En patógenos de gran importancia agronómica como Penicillium digitatum y Venturia inaequalis, la presencia de repeticiones en tándem de una secuencia de 126 bp en la región promotora del gen CYP51 se ha relacionado con la sobre-expresión de CYP51 y la disminución de la sensibilidad a azoles (HAMAMOTO et al 2000).
4) Compensación de los efectos tóxicos del fungicida por alteración de la ruta de biosíntesis o la ruta metabólica. Tanto en el caso delos DMIs, debido a que ejercen su efecto tóxico por agotamiento de ergosterolasí como la acumulación de precursores C14 metilados, y como enel caso de las estrobilurinas por la presencia de la AOX (oxidasa alternativa)que permite utilizar una ruta alternativa en la respiración mitocondrial(WOOD and HOLLOMON 2003).
Resistencia a fungicidas en patógenos de cítricos
España ocupa la quinta posición en la producción mundial de cítricos, produciendo aproximadamente 5,5 millones de toneladas (FAO, 2001), y ocupa el primer puesto en la exportación de cítricos para el consumo en fresco. El 70% de la producción nacional procede de la Comunidad Valenciana. Las especies de hongos que tienen mayor incidencia durante la conservación de los frutos cítricos son P. digitatum y P. italicum. Se estima que las pérdidas oscilan entre un 5 y un 10% del total del producto manejado en una campaña (TUSET, 1987), lo que representa un mínimo de 120 millones de euros anuales en España.
Teniendo en cuenta estos datos, se ha llevado a cabo una aproximación que permita establecer los posibles mecanismos de P. digitatum, patógeno de mayor incidencia durante la post-cosecha de cítricos, implicados en la resistencia a fungicidas.
Para ello se ha llevado a cabo el aislamiento y la caracterización de diferentes cepas de P. digitatum presentes en frutos cítricos (naranjas, mandarinas, pomelos y limones) tanto recién cosechados y por lo tanto sin ningún tipo de tratamiento fungicida o preventivo para la eliminación de posibles patógenos, como en frutos comercializados y tratados con diferentes fungicidas del tipo imazalil, tiabendazol y distintos recubrimientos céreos.
El aislamiento de los hongos se llevó a cabo mediante sucesivos pases en medio PDA hasta la obtención de micelios monospóricos que posteriormente fueron incubados en estufa a 25ºC durante 7 días para favorecer la esporulación y proceder a su conservación en glicerol al 50% a ?80ºC. Los diferentes aislados de P. digitatum se han analizado en relación a la inhibición de su crecimiento en presencia de distintos fungicidas con el fin de permitir clasificar las distintas cepas en función a su resistencia o sensibilidad.
Para determinar el crecimiento de los microorganismos se adaptó una técnica previamente utilizada por Broekaert et al 1990. Los microorganismos se incubaron en medio líquido PDB en pocillos de placas de microtítulo de 96 pocillos y se siguió la evolución de su crecimiento por la medida de la absorbancia a 595nm (A595) a diferentes tiempos de incubación, en un lector de microplacas.
Las placas se incubaron a 25ºC sin agitación. En todos los experimentos el volumen final fue de 200 ml por pocillo. La concentración óptima de conidios seleccionada fue de 2.5 x 105 conidios/ml de P. digitatum de las diferentes cepas.
Los ensayos de inhibición de crecimiento mediante el empleo de diferentes fungicidas se llevó a cabo de la forma descrita para el crecimiento pero añadiendo al medio PDB los distintos fungicidas a concentraciones crecientes de 0 a 40Ìg/ml dependiendo del fungicida empleado. Cada uno de las cepas fue ensayada por triplicado, utilizando como control de crecimiento la concentración 0 de fungicida, y como control negativo pocillos con medio PDB sin fungicida y sin inocular. Los ensayos se realizaron empleando como fungicidas imazalil (IMZ), tiabendazol(TBZ), procloraz (PCL) y miclobutanil(MCB), fludioxonil (FDX), azoxiestrobin (AZX) y trifloxiestrobin(TFX).
Teniendo en cuenta los resultados obtenidos los diferentes aislados se agruparon en función a su resistencia o sensibilidad a los diferentes fungicidas. De todos ellos se escogieron 9 aislados que correspondían a 6 resistentes y 3 sensibles (Tabla 1).
En general las cepas se muestran más sensibles al IMZ que al TBZ y es frecuente observar cepas IMZS/TBZR. El caso contrario no se ha observado y es frecuente que aislados que resultan resistentes al IMZ lo sean igualmente al TBZ, dándose una resistencia de tipo cruzado.
El estudio de resistencias se confirmó in vivo y para ello se emplearon frutos de naranja "Navel" previamente desinfectados para evitar contaminaciones.
Los frutos fueron tratados con los diferentes fungicidas mediante inmersión en balsa con la concentración seleccionada previamente a partir de ensayos "in vitro". Se practicaron 4 heridas equidistantes en la región ecuatorial de los frutos de 3 mm de profundidad, de forma que la herida alcance al albedo pero no a la pulpa. En estas heridas se inocularon con 10 ml de una suspensión acuosa de conidios recién recogidos de una placa de PDA incubada 7 días a 24ºC a una concentración de 2.0 x 105 conidios/ml. Los frutos inoculados se incubaron en cajas de plástico en una cámara a 20ºC y alta humedad relativa. Periódicamente se determinó el porcentaje de heridas infectadas y el diámetro de las zonas de maceración.
Tal y como muestra el gráfico anterior los aislados que resultaron resistentes en los ensayos in vitro también lo fueron en los ensayos in vivo confirmando así que la metodología empleada resultaba eficaz para caracterizar los aislados en función a su sensibilidad o resistencia a fungicidas. El método por lo tanto permite ensayar numerosos aislados y diversos fungicidas a diferentes concentraciones.
Identificación de marcadores moleculares implicados en resistencia a fungicidas
Uno de los mecanismos más habituales de adquisición de resistencia radica en la capacidad del hongo de eliminar de la célula los compuestos tóxicos mediante los transportadores ABC, que se caracterizan por una cierta inespecificidad.
Mutaciones en algunos de estos transportadores pueden provocar la aparición de resistencias a compuestos químicamente no relacionados como es el caso de las estrobilurinas. La aparición de reglamentos más estrictos respecto a los residuos en los frutos conlleva que una de las principales prioridades de la UE sea velar por la seguridad alimentaria mediante la reducción del empleo de fungitóxicos.
Para establecer las posibles diferencias existentes entre cepas de P. digitatum sensibles y resistentes a los fungicidas ensayados, bien para aquellos con resistencia a un único antifúngico o con resistencia múltiple, se llevó a cabo una aproximación de tipo molecular.
De todos los mecanismos descritos anteriormente relacionados con la resistencia a fungicidas se escogieron genes implicados en los diferentes tipos de resistencia. Por un lado se clonaron diferentes genes que podrían estar implicados en la resistencia a tiabendazol como el gen de la ß-tubulina, CYP51 implicado el la ruta de ergosterol y dos transportadores tipo ABC (PMR1 y PMR5) cuyo espectro de actuación puede ser muy amplio a la hora de eliminar de la célula los compuestos tóxicos.
El primer estudio realizado para evidenciar las posibles diferencias nivel molecular entre las cepas de P. digitatum sensibles y resistentes a los diferentes fungicidas fue un análisis de RFLPs en los distintos genes seleccionados, pero ninguno de ellos reveló diferencias significativas atribuibles a los distintos niveles de resistencia o sensibilidad.
La siguiente aproximación fue la secuenciación de los dos genes PMR1 y PMR5 así como del gen CYP51 en su region promotora y en el extremo 5? y de gen completo de la ß-tubulina, todo ellos genes implicados en la resistencia a fungicidas en los aislados seleccionados.
La resistencia a benzimidazoles se ha asociado a la presencia de mutaciones puntuales en el gen de la ß-tubulina que da lugar a la alteración de aminoácidos en su sitio de unión. En nuestro caso sólo se detectó una única mutación puntual en el codón 200 que se asoció con el carácter de resistencia ya que daba lugar a la sustitución de una Phe por Tyr en todas las cepas resistentes (Figura 5).
La secuenciación llevada a cabo tanto en la región promotora como codificante del extremo 5? del gen CYP51 no reveló la existencia de mutaciones a las que atribuir la aquisisición de resistencia, pero si detectar algunas mutaciones que se relacionaron con el grado de resistencia al estar presentes de forma consistente en los aislados con mayor nivel de resistencia. Además, hay que señalar que estudios preliminares realizados en la región promotora del gen CYP51 de P. digitatum indican que aunque algunas cepas resistentes a DMIs presentan las repeticiones en tándem descritas por Hamamoto y col 2000, no siempre se ha podido correlacionar la ausencia de dichas repeticiones con la característica de sensibilidad. En algunos casos, cepas con alto grado de resistencia a fungicidas DMIs, como imazalil o miclobutanil, no presentaron dichas repeticiones, lo cual refuerza la hipótesis de la existencia de varios mecanismos que confieren resistencia a compuestos similares.
Por otro lado, las secuencias obtenidas para los genes PMR1 y PMR5 revelaron algunas mutaciones puntuales el la región promotora de PMR1 y en la región codificante de PMR5 que pudieran ser responsables de al adquisición de resistencias pues sólo se encontraban presentes en los aislados resistentes.
Las técnicas aplicadas en el estudio de los mecanismos de resistencia suponen una herramienta de gran utilidad ya que podrían emplearse para diseñar regiones específicas que permitieran detectar fácilmente y sin duda alguna, la presencia de aislados resistentes a diferentes fungicidas y de esta forma llevar a cabo un uso adecuado de los fungicidas.
Conclusiones
En la estrategia para el control de resistencias hay que tener en cuenta distintos aspectos como es la higienización, particularmente en los almacenes donde se ha detectado el mayor número de aislados resistentes al estar sometidos a una presión selectiva de forma continuada. Por otra parte es necesario poder identificar la existencia o no de aislados resistentes con el fin de llevar a cabo tratamiento post-cosecha más eficaces, evitando dosis excesivas o el incremento de los niveles de residuos. Por último es preciso conocer los diferentes mecanismos implicados en la adquisición de resistencias y así cómo se regulan. Los transportadores descritos están presentes en numerosos hongos fitopatógenos y en general pueden determinar la línea base de sensibilidad a fungicidas y otros agentes antimicóticos, ser responsables a resistencia múltiple a fármacos y puedan actuar como factores de virulencia constituyendo una diana atractiva para el control químico. Por ello, inhibidores de dichos transportadores podrían mejorar la eficacia de control y reducir la virulencia.
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