Este artículo pretende resumir los trabajos de investigación realizados en los últimos 17 años, por la Unidad de Patología del Área de Postcosecha del Centre UdL-IRTA de Lleida, en el desarrollo de microorganismos para el control de las principales enfermedades de postcosecha. Fruto de este trabajo, contamos con una amplia colección de potenciales agentes de control biológico para fruta de pepita, hueso, cítricos y uva, dos de los cuales han sido patentados y cedidos los derechos de explotación a dos empresas interesadas en su comercialización. Los trabajos que se describen en este artículo pasan por el aislamiento, estudios de efectividad, producción, formulación y por las nuevas técnicas de mejora de los microorganismos, que permiten conseguir formulaciones mas estables y ampliar los huéspedes y ambientes en los que pueden actuar.
INTRODUCCIÓN
Los mohos, son los principales agentes causantes de podredumbres en la fruta conservada en cámara frigorífica. La utilización de productos químicos de síntesis es el sistema más usado para su control, pero actualmente cada vez son mayores las objeciones de orden higiénico-sanitarias que éstos plantean ya que estos productos químicos se presentan como potenciales agentes oncogénicos cuando son aplicados en las frutas y verduras. Además hay que añadir el desarrollo de resistencias a los fungicidas por parte de muchos patógenos (VIÑAS et al.
1991) y el creciente interés social sobre los peligros medioambientales. Todo esto ha generado la búsqueda de sistemas alternativos a los productos químicos de síntesis.
Existe pues una necesidad urgente de desarrollar nuevos y efectivos métodos de control de las enfermedades de postcosecha que sean aceptados por el consumidor y que no supongan un riesgo para la salud humana y el medio ambiente. El uso de técnicas no químicas y tratamientos con fungicidas no selectivos o de bajo riesgo podrían ser en el futuro respuestas para esta necesidad. La reducción del inóculo fúngico en la central hortofrutícola a través de una buena limpieza y desinfección y el uso de agentes de biocontrol pueden disminuir de forma significativa el riesgo de perdidas por postcosecha y disminuir las aplicaciones de fungicidas de síntesis.
La utilización de levaduras y bacterias como agentes de biocontrol es una alternativa muy estudiada en los últimos años (DROBY et al. 1998; JANISIEWICZ y JEFFERS, 1997, TORRES et al. 2005, USALL et al. 2001; VERO et al. 2002, VIÑAS et al. 1998), aunque hay pocos productos disponibles en el mercado. Esto debido en parte a la dificultad y al elevado coste que implica su registro, especialmente en la Comunidad Europea, con una normativa muy restrictiva para este tipo de productos, en clara contraposición con otros países como EE UU o Israel, con una normativa que favorece el registro de microorganismos. Para poder registrar un agente de control biológico es necesario, entre otras cosas, conocer su modo de acción y su impacto en el ambiente, por lo que en los últimos años también hemos desarrollado técnicas que nos han permitido conocer estos aspectos de nuestros microorganismos, aunque en este artículo no vamos a describirlos.
Otros de los factores que dificultan la aparición de productos biológicos en el mercado, es que en muchos casos su efectividad es variable, su formulación poco estable en el tiempo y su especificidad huésped-ambiente muy elevada, con lo que el mercado potencial de su utilización se ve muy restringido. Por este motivo hemos desarrollado nuevas técnicas de mejora de los agentes de control biológico, que nos permiten obtener unas formulaciones más viables y estables en el tiempo, ampliar los ambientes donde son efectivos, los patógenos a controlar y los tipos de fruta a proteger.
Desarrollo de agentes de control biológico
Aislamiento y ensayos de efectividad
Durante 17 años de trabajo hemos aislado de 2.000 microorganismos procedentes de la superficie de manzanas, peras, cítricos, melocotones y hojas de frutales de diferentes zonas de Cataluña. Estas cepas se ensayaron para determinar su capacidad de control frente a las principales enfermedades de estos cultivos.
Más del 40% de los microorganismos ensayados mostraron una cierta capacidad antagónica (>15% de reducción de la podredumbre), pero solamente el 10% redujeron el nivel de podredumbre por encima del 50%.
Después de evaluar los mejores microorganismos en ensayos de efectividad a mayor escala que el anterior, se ha obtenido una colección de bacterias y levaduras, como potenciales agentes de biocontrol. Dos de ellos se han ensayado a nivel comercial para el control de las principales enfermedades de fruta de pepita y cítricos y se han realizado estudios para aplicarlos en fruta de hueso, uva y fresas.
Una de estas cepas fue identificada como C. sake (Saito & Ota Van Uden & Buckley). Actualmente está concedida la patente a nivel del estado español y se han concedido las patentes internacionales en 17 países. La empresa de agroquímicos Sipcam Inagra SA, es detentora de los derechos de explotación de la cepa. La especie Candida sake es un microorganismo epifítico de diversos materiales vegetales (manzanas, uvas, tomates, etc.) y no se encuentra asociada a animales de sangre caliente.
La cepa CPA-1 de C. sake, muestra una gran capacidad inhibidora del desarrollo de las principales enfermedades de postcosecha tanto en manzanas como en peras. Esta cepa de levadura está muy adaptada a las bajas temperaturas y a las condiciones de atmósfera controlada habituales en las centrales hortofrutícolas.
En estas condiciones de conservación, la cepa CPA-1 de C. sake tanto a la concentración 1 x 106, como de 1 x 107 ufc/ml mostró una excelente capacidad de reducción de la podredumbre en ensayos comerciales en centrales de Lleida, obteniéndose niveles de reducción de las podredumbres igual o superior a los productos químicos de síntesis habituales en la zona (Figura 1).
Con la finalidad de evaluar la efectividad del producto formulado por nosotros en aplicaciones prácticas comerciales, se realizaron ensayos durante varias campañas con manzanas y peras en Lleida, en Lanxade (Francia) y en Boloña (Italia), aplicando el agente de biocontrol mediante "drencher" a la fruta recién recolectada. Después de 5-7 meses de conservación en atmósfera controlada, se observó que la fruta tratada con C. sake mostraba una gran capacidad de control de las principales enfermedades de postcosecha. Los niveles de podredumbre de la fruta tratada con C. sake fueron estadísticamente inferiores a los observados con la fruta sin ningún tratamiento e iguales a las frutas tratadas con los productos químicos de síntesis habituales.
El otro antagonista ya evaluado a nivel comercial es la cepa CPA-2 de la bacteria Pantoea agglomerans. Esta bacteria fue aislada de la superficie de manzanas "Golden Delicious" y es efectiva contra las principales enfermedades en postcosecha de fruta de pepita y de cítricos. También esta patentada y los derechos de explotación los detenta la empresa DOMCA S.A. En ensayos comerciales en varias centrales de Lleida sobre manzanas y peras se pudo comprobar su efectividad, consiguiendo niveles de efectividad iguales o superiores a los fungicidas habituales en la zona.
En los estudios realizados en naranjas "Valencia" se determinó que la concentración efectiva del antagonista era de 2x108 ufc/ml, controlando la incidencia de la podredumbre verde en más del 75%, después de 7 días de conservación a 20ºC. Se observó también que la población de la bacteria se multiplicaba y se mantenía en las heridas inoculadas, tanto en los frutos incubados a 20ºC durante 14 días como en los conservados a 3ºC durante 60 días. Por otra parte, en estudios posteriores realizados con este agente de biocontrol en limones y en naranjas en Cataluña, Andalucía, sur de Portugal y California se demostró su alto nivel de efectividad en varias zonas citrícolas del mundo.
Dados los excelentes resultados obtenidos con las soluciones de bicarbonato sódico a 40ºC en estudios previos, y la conocida compatibilidad del bicarbonato sódico con la cepa CPA-2 de P. agglomerans, se planteó la posibilidad de combinar ambos métodos de control. Así, se demostró que la aplicación de P. agglomerans posteriormente a un baño con bicarbonato sódico caliente (40ºC), reducía significativamente la incidencia de la podredumbre azul y verde en naranjas ?Valencia?, respecto de los frutos tratados con el agente de biocontrol o con la sal sódica por separado. Este estudio, realizado a nivel semicomercial y comercial en una línea de tratamiento de cítricos, demuestra que la sustitución de productos químicos de síntesis por sustancias naturales es posible a corto plazo. Esta combinación es muy interesante, ya que elimina las infecciones existentes y protege al fruto de las posibles reinoculaciones.
Producción y formulación
Una vez conocido el potencial antagónico de los microorganismos, es necesario poderlos producir de forma masiva con un medio de cultivo económico así como optimizar todo el proceso tecnológico de producción industrial. Posteriormente se realizó el proceso de formulación y envasado, para ofrecer un producto totalmente listo para su uso comercial.
Existe una gran dificultad de encontrar información disponible sobre los métodos de producción y formulación de los microorganismos comerciales, debido a que en la mayoría de casos han sido realizados por empresas privadas que no divulgan los resultados. Por este motivo iniciamos nuestros estudios con muy poca información de partida y fueron necesarios varios años de trabajo para determinar unos medios de cultivo económicos para cada uno de los agentes de control biológico y optimizar las condiciones de crecimiento, tanto a nivel de laboratorio como de planta piloto, realizando incluso algunos estudios a escala comercial.
En la Figura 2 podemos observar la curva de crecimiento de C. sake con un medio a base de urea y melazas de caña de azúcar, con el que se obtienen poblaciones superiores a 8x108 ufc/ml después de 32 h de crecimiento en un fermentador de planta piloto de 90 litros.
La formulación es necesaria para presentar el producto en una forma utilizable y para optimizar la eficacia, estabilidad, seguridad y facilidad de aplicación.
Estas formulaciones pueden ser líquidas o sólidas. A su vez las formulaciones líquidas se pueden preparar en base acuosa, oleosa, polimérica o sus combinaciones.
Las formulaciones sólidas pueden ser en polvo, gránulo, etc y se deshidratan mediante diferentes métodos, entre lo que hay que destacar gel de sílice, liofilización, leche fluido y atomización. En nuestro laboratorio hemos ensayado la mayoría de estas técnicas y los mejores resultados se han obtenido en solución líquida acuosa y secado en lecho fluido para la levadura C. sake y en liofilización para la bacteria P. agglomeras.
Con el objetivo de mejorar la viabilidad a lo largo del tiempo hemos desarrollado una formulación líquida en soluciones isotónicas con cepas crecidas en medio restrictivo. Esta nueva formulación consiste en producir el agente de control biológico en un medio de cultivo con un alto contenido de una sustancia que reduzca la cantidad de agua disponible para el microorganismo. Una vez producido se mide el potencial hídrico del interior de las células y se prepara una solución con algún soluto que consiga mantener esta solución al mismo potencial hídrico que el interior de la célula, con el objetivo de evitar perdidas de agua y por tanto la muerte de la célula. Para el caso de C. sake se realizó una formulación añadiendo sorbitol al medio de cultivo y trealosa a la solución isotónica, consiguiendo una viabilidad el 100% por más de 7 meses, sin reducciones de su efectividad en el control de las enfermedades (Foto 1).
En el caso de las formulaciones sólidas, al igual que en las líquidas es necesario añadir sustancias protectoras antes de realizar el proceso de secado, pero en este caso, además hay que pensar en buscar un buen medio de rehidratación antes de aplicar el producto y después del largo periodo de conservación. En el caso de P. agglomerans, se observó que el mejor medio de rehidratación consistía en una solución al 10% de leche desnatada en polvo (Figura 3).
Mejora
La mejora de la acción de un agente de biocontrol se puede plantear en varios aspectos, desde la combinación con otros agentes de biocontrol, el aplicarlo conjuntamente con algunos nutrientes que mejoren su capacidad de crecimiento o combinarlo con otros sistemas de control. Pero en este trabajo vamos a describir otro tipo de mejora, el del propio micoorganismo, modificando sus reservas endógenas, con el objetivo que pueda sobrevivir en condiciones estresantes de alta temperatura y baja humedad relativa, como las que se pueden dar en el proceso de secado y en las posibles aplicaciones en campo.
Su aplicación en precosecha para el control de enfermedades en postcosecha aportaría una serie de ventajas como son, la prevención de infecciones producidas en campo, una menor manipulación de la fruta, disminución del periodo entre cosecha y conservación y finalmente se evitaría la contaminación adicional por hongos presentes en las soluciones de los "drenchers". Sin embargo, la aplicación de los agentes de biocontrol en condiciones de campo se ha visto a menudo limitada por el estrecho margen de temperatura y humedad relativa al que son capaces de establecerse y sobrevivir, no pudiendo así controlar una plaga o enfermedad.
En estudios ecofisiológicos recientes con C. sake y P. agglomerans, hemos demostrado que cuando se hacen crecer en condiciones de baja actividad de agua (aw) o alta temperatura en algunos momentos de su crecimiento, se produce una modificación en las reservas endógenas que acumulan y esto se traduce en una mayor resistencia a condiciones de estrés hídrico.
La demostración del mantenimiento de la efectividad como agentes de biocontrol de las cepas modificadas es de particular importancia, ya que sugiere que los cambios ecofisiológicos provocados en estas células no afectan su capacidad de biocontrol y seguramente pueden incluso mejorarlo. Así pues, se llevaron a cabo ensayos de laboratorio y de campo para comparar la efectividad de las cepas aw-tolerantes y Tª-tolerantes frente a la no modificada. En laboratorio se observó que los niveles de efectividad eran los mismos. En el caso de los ensayos de campo, estos consistieron en la aplicación del antagonista sobre manzanas artificialmente agujereadas, inoculadas con P. expansum y conservadas en frío durante 4 meses. Los resultados de los mismos, no mostraron diferencias significativas en la efectividad de biocontrol conseguidas con las tres cepas ensayadas. Sin embargo, la menor adherencia al fruto y el mayor crecimiento de la población que presentaron las cepas que habían sido modificadas hacen pensar que los requerimientos de energía para la producción de reservas endógenas pueden resultar en una modificación de la concentración y características de la matriz extracelular de la levadura. Probablemente una mejora de la adherencia de las células modificadas podría traducirse en una mayor efectividad.
Resultados parecidos se obtuvieron con P. agglomerans aplicada en campos de cítricos. Por ese motivo se evaluó la viabilidad de mejorar la supervivencia de P. agglomerans mediante la adición de diferentes substancias como son aceites de verano, aditivos alimentarios, etc. Los mejores resultados de supervivencia se obtuvieron con el recubrimiento alimentario llamado Food Coat. Se comprobó que el agente de biocontrol crecido a bajas aw, formulado y aplicado en campo junto con Food Coat presentaba una mejor supervivencia en la superficie de las naranjas y que además se obtenía una buena efectividad en el control de ambos patógenos en postcosecha.
Otros estudios han demostrado que cepas mejoradas de C. sake son efectivas en el control de Aspergillus negros y Botrytis cinerea en viña.
Todos estos resultados que hemos presentado demuestran el gran potencial de la aplicación de microorganismos para el control de las principales enfermedades de postcosecha de fruta.
BIBLIOGRAFÍA
DROBY S., COHEN L., DAUS A., WEISS B., HOREV B., CHALUTZ E., KATZ, H, KEREN-TZUR M., SHACHNAI A. 1998. Commercial testing of Aspire: a yeast preparation for the biological control postharvest decay of citrus. Biol. Control 12: 97-101
JANISIEWICZ W. J., JEFFERS S.N. 1997. Efficacy of commercial formulation of two biofungicides for control of blue mold and gray mold of apples in cold storage. Crop Protection. 16: 629-633
TORRES R., TEIXIDÓ N., USALL J., ABADÍAS N., VIÑAS I. 2005. Postharvest control of Penicillium expansum on pome fruits by the bacterium Pantoea ananatis CPA-3. J. Horticultural Science and Biotechnology, 80 (1): 75-81
USALL J., TEIXIDÓ N., TORRES R., OCHOA DE ERIBE X., VIÑAS I. 2001. Pilot test of Candida sake (CPA-1) applications to control postharvest blue mold on apple fruits. Postharvest Biol. Technol 21:147-156
VERO S., MONDINO P., BURGUEÑO J., SOUBES M., WISNIEWSKI M. 2002. Characterization of biocontrol activity of two yeast strains from Uruguay against blue mold of apple. Postharvest Biol. Technol 26:91-98
VIÑAS I.; USALL J.; TEIXIDÓ N.; SANCHIS V. 1998. Biological control of major postharvest pathogens on apple with Candida sake. International Journal of Food Microbiology, 40: 9-16.
VIÑAS I., USALL J., SANCHIS V. 1991. Tolerance of Penicillium expansum to postharvest fungicide treatment in apple packinghouses in Lleida (Spain). Mycopathologia 113, 15-18.
Comprar Revista Phytoma 189 - MAYO 2007
