El presente estudio evalúa la acción fungicida de extractos de Ecballium elaterium sobre dos hongos fitopatógenos del suelo: Phytophthora citrophthora y Rhizoctonia solani. El estudio se realizó empleando cultivos in vitro de ambos hongos. Los medios de cultivo fueron tratados con extractos de distintas concentraciones y distintos órganos de E. elaterium en DMSO. La inhibición se analizó midiendo el diámetro de las colonias fúngicas. No hubo diferencias en la inhibición generada por las distintas concentraciones de los extractos de toda la planta, pero sin embargo la respuesta fue diferente para los distintos hongos y para los distintos órganos de la planta. Los resultados mostraron que ciertos órganos de E. elaterium son una posible fuente de fungicidas naturales.
INTRODUCCIÓN
En los últimos años son numerosas las investigaciones realizadas sobre plaguicidas y fungicidas de origen natural, ya que con su uso es posible evitar muchos de los inconvenientes que presentan ciertos fungicidas sintéticos tradicionales. Entre los campos estudiados, está la obtención de compuestos antifúngicos de origen vegetal. Estas moléculas presentan cuantiosos beneficios entre los que destaca su baja persistencia y su rápida biodegradabilidad a productos no tóxicos. Estas características evitan los efectos nocivos sobre el medio y la generación de residuos tóxicos en los productos vegetales tratados, impidiendo su paso a la cadena alimenticia y, en último término, al hombre.
Además, los compuestos bioactivos vegetales son selectivos, ya que actúan contra un número limitado de especies, lo que reduce la aparición de desequilibrios ecológicos (por eliminación de organismos útiles, etc.). Por otra parte, la existencia, en muchas ocasiones, de varias moléculas antifúngicas en una misma especie vegetal, dificulta la aparición de resistencias en los patógenos (BELLÉS y col., 1988; CARMONA y col., 2001).
De entre las plantas susceptibles de contener principios antifúngicos, es lógico pensar que muchas de las llamadas "malas hierbas", precisamente por su resistencia y la dificultad de su erradicación, presentan algunos de estos compuestos. El presente estudio se realizó con el fin de comprobar si la planta Ecballium elaterium (L.) A. Richard, una mala hierba conocida vulgarmente como pepinillo del diablo y muy abundante en la Comunidad Valenciana, poseía principios con carácter antifúngico así como de determinar y optimizar en su caso la eficacia de éstos. Existen ciertos estudios que demuestran la actividad insecticida de extractos de hojas de Ecballium elaterium sobre el coleóptero Tribolium castaneum. La planta presenta un efecto repelente e inhibitorio del crecimiento sobre la fase de larva y toxicidad de contacto en la fase de pupa de T. castaneum (PASCUAL-VILLALOBOS Y ROBLEDO, 1999). Sin embargo, no se ha encontrado bibliografía referente a la posible actividad fungicida de E. elaterium.
En este trabajo se ensayaron los efectos de extractos de E. elaterium sobre dos hongos fitopatógenos del suelo; Phytophthora citrophthora y Rhizoctonia solani. P. citrophthora es un parásito virulento de los cítricos y el kiwi que produce pudrición del cuello, las raíces y los frutos de los árboles; esta enfermedad es conocida como "gomosis de los cítricos". R. solani, en cambio, ataca a una amplia gama de cultivos, entre ellos las judías, las coles, la patata, etc. Los síntomas más comunes causados por este hongo en la mayoría de las plantas son el ahogamiento de las plántulas y la pudrición de la raíz, así como la pudrición y la cancrosis del tallo de las plantas adultas y en proceso de crecimiento (AGRIOS, 2002; SMITH y col., 1992).
Material y métodos
En primer lugar se procedió a la recolección de la especie vegetal objeto de estudio (Figura 1) y a la separación y secado de los distintos órganos de la planta (flores, tallos, raíz, hojas y frutos). El material vegetal se introdujo en una estufa Raypa con distribución de calor por convección natural, manteniéndose durante ocho días a unos 65ºC. Tras la molienda del material vegetal seco se prepararon los extractos vegetales empleando el extractante dimetil sulfóxido (DMSO) suministrado por Scharlau Chemie, de una pureza mínima del 99?5%.
Se realizaron dos ensayos. En el primero de ellos se probaron, en los dos hongos, tratamientos consistentes en extractos procedentes de una mezcla en partes iguales de todas las fracciones (órganos) de E. elaterium. Se usaron aquí extractos con distintas concentraciones de esta mezcla para comprobar cual era la dosis más efectiva. Para la elaboración de los extractos se tomaron tres viales y se añadieron en cada uno 10 mL de DMSO.
Además, en cada vial se introdujeron respectivamente 0?05, 0?1 y 0?2 g de material seco "mezcla de toda la planta", dando lugar, tras un proceso de agitación (900 revoluciones por minuto durante 24 horas) y filtración, a los extractos "1", "2", y "3".
En el segundo ensayo se utilizaron tratamientos con extractos de similar concentración, pero procedentes de las distintas fracciones de la planta, con el fin de detectar posibles diferencias en la eficacia antifúngica de los diversos órganos. Los extractos se prepararon tomando 5 viales e introduciendo 10 mL de DMSO dentro de cada uno. A continuación se añadieron a cada vial 0?1 g de flores, raíz, hojas, frutos y tallos secos respectivamente, procedentes de Ecballium elaterium.
Todos los medios de cultivo empleados en este proyecto se elaboraron utilizando PDA suministrado por Laboratorios Microkit. Para cada ensayo se prepararon los medios problema (medios tratados con extractos), y dos tipos de medios control; uno únicamente con PDA ("control sin DMSO"), y otro que contenía PDA y el extractante DMSO ("DMSO"), este último en cantidad similar a la de extracto en los medios tratados.
En el primer ensayo (ensayo con toda la planta) los medios problema se prepararon mezclando 4?68 g de PDA, 6mL de extracto "1", "2" o "3" según el caso y agua destilada hasta alcanzar un volumen de 120 mL. Finalmente, de cada tipo de medio, se obtuvieron 6 placas Petri con unos 20 mL de medio, 3 para inocular cada hongo. Las concentraciones finales de material vegetal seco en los distintos medios problema fueron 0?25 g/L, 0?5 g/L y 1g/L, para los medios que contenían extracto "1", "2" y "3" respectivamente. Los medios problema del segundo ensayo (ensayo con los distintos órganos) se prepararon mezclando 7?8 g de PDA, 10 mL de extracto de flores, tallos, raíz, hojas o frutos según el caso y agua destilada hasta los 200 mL. La concentración final de material vegetal seco fue de 0?5 g/L en todos los medios problema y se realizaron cinco réplicas por tratamiento (órgano vegetal).
Para la inoculación de los hongos en los medios de ambos ensayos se partió de material fúngico activado a partir de cepas puras de Phytophthora citrophthora y Rhizoctonia solani procedentes de la Colección Española de Cultivos Tipo (Universidad de Valencia). Este trabajo se realizó con la ayuda de un tubo cilíndrico metálico de 7 mm de diámetro con el que se perforaba el cultivo activado, transfiriéndose posteriormente las porciones circulares de medio con micelio al centro de las placas que contenían los distintos medios (medios problema y medios control) (Figura 2.a). Después de inocular los cultivos, se almacenaron a unos 25ºC en una estufa bacteriológica y se midió el diámetro de la colonia fúngica de todos ellos dos veces diarias, efectuándose dos medidas perpendiculares del diámetro de la colonia en cada placa (Figura 2.b). Estas medidas se prolongaron aproximadamente ocho días en los dos ensayos realizados, tiempo tras el cual en los medios "control sin DMSO" (medio en que los hongos crecían más rápido) las placas de cultivo estaban totalmente cubiertas por micelio.
Los resultados de las mediciones realizadas se analizaron empleando los programas informáticos SPSS y Excel. Los porcentajes de inhibición del crecimiento fúngico se calcularon tomando como base la siguiente fórmula: Porcentaje de inhibición del crecimiento fúngico = (DC-DT)*100/DC; donde DC es el diámetro medio de la colonia fúngica crecida en el medio control ("DMSO" o "control sin DMSO" (PDA) según el caso), y DT el diámetro de la colonia fúngica crecida en medios que contenían un determinado tratamiento. En este caso, para aumentar en la medida de lo posible la exactitud del cálculo del porcentaje de inhibición, se restó 0?7 cm (diámetro del disco de medio con micelio inoculado) a cada uno de los diámetros que aparecían en la ecuación resultando la fórmula final siguiente:
Porcentaje de inhibición del crecimiento fúngico = (DC - DT)*100/(DC ? 0?7). Se calculó este porcentaje de inhibición para cada uno de los diámetros medidos de las distintas réplicas de los medios tratados. Los porcentajes de inhibición que se reflejan en este artículo para un medio determinado, se corresponden así con promedios de los porcentajes de inhibición calculados para cada una de sus réplicas.
