La Normativa Europea obliga al etiquetaje de los alimentos y piensos cuando el contenido de Organismos Genéticamente Modificados o OGM, es superior al 0,9%. Esto ha incidido en la necesidad de poner a punto unos métodos de detección de OGM que respondan a la legislación establecida por la Unión Europea. Los mecanismos de detección de transgénicos deben estar adaptados a cada producto bruto o derivado y a cada OGM buscado. Los métodos de análisis que detectan el ADN transgénico son los más utilizados. La técnica conocida como Reacción en Cadena de la Polimerasa o PCR, permite obtener gran cantidad de ADN idéntico al de partida, camino indispensable para llegar a detectar, identificar y cuantificar el OGM de interés.
Conceptos
Un Organismo Genéticamente Modificado, desde ahora OGM, es un organismo, a excepción de los seres vivos, el material genético del cual ha sido modificado de manera que no se produce naturalmente en el apareamiento ni en la recombinación natural. Cuando la modificación se ha producido mediante la incorporación a su genoma de un fragmento de ADN que procede de otra especie, se dice que el OGM es un organismo transgénico.
En general, un OGM tiene una combinación nueva de material genético que le confiere nuevas propiedades: resistencia a plagas, resistencia a herbicidas, producción de sustancias de interés nutritivo, organoléptico o farmacológico (Figura 1). Esto implica que se ha modificado el material genético del animal o de la planta del cual proviene el alimento o alguno de los ingredientes que contiene, o bien que se ha modificado el material genético de alguno de los microorganismos implicados en el proceso de elaboración del alimento.
En este sentido, alimentos y piensos genéticamente modificados (GM) son aquellos que contienen o están compuestos por OGM o han estado producidos a partir de ellos.
Reglamento (CE) Nº 1829/2003
El Reglamento (CE) Nº 1829/2003 del Parlamento Europeo y del Consejo de 22/09/2003 sobre alimentos y piensos modificados genéticamente aplicable desde Abril de 2004, estableció los procedimientos comunitarios para la autorización y supervisión de los alimentos y piensos GM y las disposiciones relativas al etiquetaje de los alimentos y piensos GM. Esto incidió en las metodologías de detección de OGM.
El reglamento establece que el etiquetaje será obligatorio cuando el contenido de OGM sea igual o superior al 0.9% de cada ingrediente considerado individualmente (Figura 2). Por ejemplo, en un producto procesado que contenga maíz y soja, el porcentaje de OGM permitido no es el 0.9% del producto final, sino el 0.9% de maíz y el 0.9% de soja (Figura 3).
También se acepta el 0.5% de la presencia accidental o técnicamente inevitable de material GM, si el OGM aún no ha estado aprobado por la Unión Europea, desde ahora UE, pero está en proceso de evaluación favorable.
La normativa europea establece como obligatorio el etiquetaje de los alimentos y piensos cuando el contenido de OGM sea igual o superior al 0.9%
Detección de OGM
Con el objetivo de facilitar el cumplimiento de los Reglamentos Europeos, el análisis de material transgénico en alimentos debe ser aplicable tanto a materias primas como a alimentos procesados y debe permitir detectar y cuantificar la presencia o ausencia de material transgénico. Detectar si estamos delante de un OGM, no es una tarea fácil. El método más fiable para saber si un alimento es transgénico es analizar su material genético o ADN o analizar su composición para identificar la presencia de proteínas derivadas de la actividad del ADN transgénico. A pesar de ello, los métodos moleculares fiables y sensibles, funcionan muy bien con material vegetal fresco o poco procesado, pero tienen menos sensibilidad cuando este material ha sido sometido a procesos industriales de elaboración de alimentos preparados o de purificación de sus componentes.
Diferentes procesos químicos, físicos o enzimáticos pueden contribuir a la degradación del ADN. Incluso en alimentos que por su proceso han sufrido una gran degradación de su ADN o de sus proteínas no se pueden hacer estos análisis ya que no se encuentran restos de éste, o casi no quedan trazas en forma de fragmentos cortos de los productos de degradación.
El proceso de detección de OGM engloba tres etapas (Figura 4):
- Detectar la presencia o ausencia de OGM.
- Identificar si son OGM autorizados en la UE.
- Cuantificar si los OGM identificados no superan el 0,9% permitido en la UE.
El método más fiable para saber si un alimento es transgénico es analizar su material genético o ADN o analizar la presencia de proteínas derivadas de la actividad del ADN trasgénico.
Métodos de detección
La obligatoriedad de etiquetar los alimentos transgénicos plantea la puesta a punto de unos métodos de análisis:
- Adaptados a cada producto bruto o derivado y a cada OGM buscado.
- Fiables y sensibles para responder a la legislación establecida y a una información de calidad exigida por los consumidores.
- Homogéneos para todos los laboratorios europeos para garantizar los resultados.
Para que los métodos de detección de OGM cumplan todos estos requisitos, deben ser:
- Específicos, es decir, tienen que ser capaces de detectar y identificar el OGM buscado.
- Sensibles, es decir, tienen que ser capaces de detectar un porcentaje de OGM igual o inferior al limite marcado por la normativa europea.
- Precisos, es decir, a partir del uso de materiales de referencia, tenemos que demostrar que son métodos estadísticamente representativos.
- Repetibles, es decir, el resultado de un análisis tiene que ser el mismo cuando este se repite con el mismo método, con idénticas características del test, en el mismo laboratorio, por el mismo analista y utilizando el mismo equipo dentro de un intervalo corto de tiempo.
- Reproducibles, es decir, el resultado de un análisis tiene que ser el mismo cuando éste se repite con el mismo método, con idénticas características del test, en diferentes laboratorios, por diferentes analistas y utilizando equipos diferentes.
A partir de la capacidad de detección de los métodos, los podemos clasificar en dos grandes grupos:
- Detectar la expresión del gen, es decir, proteínas: Método ELISA.
- Detectar el gen responsable, es decir, ADN: Método PCR.
Los métodos de análisis que detectan el ADN transgénico son los más utilizados ya que proporcionan más especificidad y sensibilidad, no obstante, en determinadas ocasiones, puede interesar la detección de proteínas. Comparación de las características entre ambas técnicas (Tabla 1).
Método Enzyme-Linked Immunosorbent Assay: ELISA.
El ensayo inmunoenzimático ELISA. se basa en la detección de antígenos o anticuerpos en una muestra.
En el caso de la detección de antígenos, los anticuerpos específicos para el antígeno se adhieren a la superficie de plástico de la placa inmunoadsorbente que nos hace de soporte. Después se añade la muestra que actúa de antígeno en el caso de ser positiva. A continuación se añade el anticuerpo adherido a un enzima específico para el antígeno. Finalmente, se añade un sustrato específico que al actuar el enzima producirá color observable a simple vista o cuantificable al espectrofotómetro (Figura 5).
En el caso de la detección de anticuerpos, los antígenos se adhieren a la superficie de plástico de la placa. Después se añade la muestra que actúa de anticuerpo en el caso de ser positiva.
A continuación se añade el anticuerpo adherido a un enzima específico para el anticuerpo. Finalmente, se añade un sustrato específico que al actuar el enzima producirá color observable a simple vista o cuantificable al espectrofotómetro (Figura 6).
Reacción en cadena de la Polimerasa: PCR
El objetivo de la PCR es la obtención de gran cantidad de ADN. A partir de una muestra que contenga una cantidad mínima de material genético difícil de manipular o detectar se puede obtener una gran cantidad de ADN idéntico al de partida.
El ADN es una molécula termoestable y está presente en todas las células de un organismo. Estas características lo convierten en la diana perfecta para detectar la presencia de OGM en materias primas y alimentos. La PCR es capaz de detectar la presencia de ADN aunque se encuentre en cantidades muy pequeñas.
La PCR permite copiar muchas veces un fragmento específico de ADN, es decir, mediante una amplificación de un trozo de ADN, obtenemos millones de copias. El ADN tiene dos cadenas complementarias que tienen la misma información y para copiarla es necesario separar físicamente las dos cadenas y utilizar cada una de ellas como un molde, es decir, como una plantilla que sirve de modelo en forma de espejo, para sintetizar la otra. Esta tarea la hace un enzima llamado ADN polimerasa, que en este caso es termoresistente para soportar las elevadas temperaturas que se utilizan en la etapa de separación de las dos cadenas de ADN en cada ciclo de copiado.
Para que la ADN polimerasa inicie la copia de las cadenas de ADN se necesitan dos "primers" o cebadores, que son pequeños fragmentos de ADN complementarios a los extremos de ambas cadenas y que al engancharse al ADN actúan como un primer anillo de la cadena para que se inicie su copia. Estos cebadores dan especificidad al proceso de amplificación y por ello el diseño de los cebadores requiere conocer la secuencia del ADN específico que se va a amplificar (Figura 7).
La PCR permite obtener gran cantidad de ADN idéntico al de partida.
El proceso de amplificación o copiado tiene lugar en un aparato llamado termociclador que permite programar automáticamente ciclos sucesivos de calentamiento y enfriamiento de las muestras que contienen el material genético.
La reacción se realiza mediante la repetición (20 ? 40 ciclos) del proceso de copia, de forma que la amplificación se produce de manera exponencial, y se obtienen al final del proceso 2n copias del fragmento de ADN; "n" es el numero de ciclos que se realizan en el termociclador (Figura 8).
Detección de OGM vía PCR
El proceso de detección de transgénicos engloba una serie de etapas sucesivas tal como esquematiza la Figura 9.
Extracción del ADN
El objetivo de la extracción del ADN es obtener la suficiente cantidad de ADN y que sea de buena calidad, es decir, el menos degradado posible y libre de contaminantes. La degradación de ADN y las contaminaciones reducen la eficiencia de la PCR i puede llevarnos a resultados erróneos.
Se han descrito muchos métodos para extraer ADN de materias primas y productos finales, algunos de ellos más indicados para un tipo de matriz determinada y otros de aplicación más amplia.
Control de calidad del ADN extraído
La calidad del ADN extraído se controla de forma consecutiva y complementaria mediante:
- La cuantificación del ADN al espectrofotómetro.
- Un gel de calidad.
- Genes específicos.
La amplificación vía PCR de genes específicos de organismos eucariotas o genes endógenos de las especies con las que se está trabajando, permite identificar la presencia de ADN de una especie determinada y a su vez ver si hay inhibidores de la PCR. Por ejemplo, para muestras de maíz se utiliza el gen de la Zeina, que se encuentra tanto en variedades transgénicas como en variedades no transgénicas de maíz. Para muestras de soja se utiliza el gen de la Lectina, que se encuentra tanto en variedades transgénicas como en variedades no transgénicas de soja. La imagen superior de la izquierda de la Figura 10 muestra la respuesta de señal para el gen de la Lectina en muestras de soja (S) y muestras mezcla de maíz y soja (BS). La imagen superior derecha de la misma figura muestra la respuesta de señal del gen de la Zeina en muestras de maíz (B) y muestras de mezcla de maíz y soja (BS).
Una señal intensa en la amplificación de la PCR indica un ADN de calidad. Si no se obtiene una buena señal, se cuestiona la calidad del ADN y se vuelve a purificar o se hace otra extracción.
Screening mediante secuencias reguladoras
Después de comprobar que la muestra tiene un ADN de calidad, el siguiente paso es ver si contiene o no contiene OGM. La detección del transgén o ADN transgénico se realiza mediante la amplificación específica de un fragmento del mismo utilizando la técnica de la PCR.
Las secuencias reguladoras son interruptores que controlan la expresión del gen. Muchos de los vegetales transgénicos son portadores de secuencias de ADN características, el promotor CaMV35S y el terminador T-nos.
Si el alimento contiene estos transgenes, se obtendrá una señal positiva en la reacción de la PCR, tal y como vemos en la imagen inferior de la Figura 10, dónde las muestras transgénicas de maíz (B), soja (S) y mezcla de maíz y soja (BS) dan señal para estas secuencias.
Los genes específicos permiten controlar la calidad del ADN extraído. la detección de secuencias reguladoras nos indica que estamos frente a un organismo genéticamente modificado. Identificación
Después de detectar que estamos delante de un OGM, identificaremos de qué OGM se trata mediante la amplificación por PCR de secuencias específicas.
El objetivo es la identificación del OGM para saber si está o no autorizado y, en el caso de que lo este, para que usos esta permitido.
Un ejemplo conocido es el gen cry1A (b) que codifica para la toxina Bt de maíz Bt 176 y el gen EPSPS de la tolerancia al herbicida glifosato de la soja Roundup Ready (Figura 11).
Cuantificación
La cuantificación de OGM ha llegado a ser muy importante en los últimos años, a raíz de la normativa europea (ver Reglamento (CE) Nº 1829/2003).
El umbral obligatorio de etiquetaje del 0.9% de OGM establecido por la UE hace que cada vez sean más necesarios los análisis cuantitativos que indican la proporción de OGM en la muestra, en lugar de los cualitativos que sólo nos indican la presencia o la ausencia de OGM.
Las características de la PCR cuantitativa hacen de ella un proceso idóneo como mecanismo de detección de OGM:
- Método que responde a las necesidades creadas por la normativa europea.
- Se basa en la cuantificación exacta del porcentaje de producto trangénico presente en la muestra.
- Mide la cantidad del producto amplificado después de cada ciclo de la PCR mientras ésta está en marcha.
- El resultado final es la emisión de fluorescencia, la cual es proporcional a la cantidad del producto amplificado.
- La fluorescencia emitida se convierte en cantidad de OGM gracias al tratamiento informático de los datos y permite expresar los resultados en porcentaje de OGM en la muestra.
La detección de secuencias especificativas permite identificar el tipo de OGM y saber si estamos delante de un ogm autorizado o no.
La PCR cuantitativa permite determinar si estamos dentro del umbral de OGM establecido por la normativa.
Métodos basados en la cuantificación:
SYBR Green: Se basa en la medición de fluorescencia emitida al intercalarse las moléculas de colorante fluorescente SG entre los puentes de hidrogeno de las moléculas de doble hélice de ADN (Figura 12).
Sondas FRET: Se basa en la medición de fluorescencia emitida mediante sondas de hibridación específicas del transgén marcadas con un fluorocromo (Figura 12).
Integración del Departament d?Agricultura, Ramaderia i Pesca de la Generalitat de Catalunya (DARP) a las entidades europeas en el ámbito de los OGM
El DARP, a través del Laboratorio Agroalimentario, es miembro de diversas entidades nacionales y europeas.
Mediante la participación a las reuniones que se celebran periódicamente, está constantemente actualizado de los avances tecnológicos sobre los procesos de detección de transgénicos.
- Red Europea de Laboratorios de OGM, ENGL (European Network of GMO Laboratories).
Miembro con derecho a voto desde su creación en diciembre del año 2002.
La Red fue creada por acuerdo entre la Unión Europea y los laboratorios europeos responsables del muestreo, la detección, la identificación y la cuantificación de OGM. El objetivo es armonizar y estandarizar el desarrollo y la validación de métodos para la trazabilidad de los OGM.
- Comité Europeo de Normalización, CEN. Delegado español con derecho a voto al Grupode Trabajo de OGM desde su formación en septiembredel año 1999.
El CEN trabaja en la elaboración de los métodos de detección de OGM que pasaran a ser normas europeas EN.
- Asociación Española de Normalización y Certificación, AENOR. Miembro con derechoa voto desde su formación en agosto del año1999.
Como delegado español de AENOR al CEN informa de las decisiones tomadas a nivel del Estado Español al grupo europeo y informa de las decisiones tomadas a nivel de la UE al grupo español. AENOR trabaja y traduce las normas europeas que una vez adoptadas pasaran a ser normas españolas UNE.
BIBLIOGRAFÍA
EN ISO 21569: 2005. Foodstuffs ? Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products ? Qualitative nucleic acid based methods. CEN/TC 275/WG 11.
EN ISO 21570: 2005. Foodstuffs ? Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products ? Quantitative nucleic acid based methods. CEN/TC 275/WG 11.
EN ISO 21571: 2005. Foodstuffs ? Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products ? Nucleic acid extraction. CEN/TC 275/WG 11.
EN ISO 21572: 2004. Foodstuffs ? Methods for the detection of genetically modified organisms and derived products ? Protein based methods. CEN/TC 275/WG 11.
EN ISO 24276: 2005. Foodstuffs ? Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products ? General requirements and definitions. CEN/TC 275/WG 11.
ERLICH, H.A., 1989. PCR technology. Principles and Applications for DNA Amplification. Stockton Press.
TAMAMES, R., 2003. Los transgénicos, conózcalos a fondo. Ed. Ariel.
