Sección: Patata
Abstract: La bacteria Pectobacterium (Erwinia) chrysanthemi en cultivos de patata sólo ha sido aislada de forma esporádica en España, a pesar de su presencia generalizada en otros países europeos. Aunque el patógeno se ha detectado en distintas regiones durante los últimos años, los aislados españoles no habían sido bien estudiados. Se ha desarrollado un nuevo sistema de microplacas para la determinación de biovares. La caracterización de 13 aislados ha permitido su clasificación en los biovares 1, 3, 5 y 6. La introducción de P. chrysanthemi en España parece estar relacionada con importaciones de patata de siembra con infecciones latentes.
Aunque pueden afectar a un amplio rango de cultivos, tres especies bacterianas del género Pectobacterium (Erwinia), P. atrosepticum, P. carotovorum y P. chrysanthemi, se cuentan entre los patógenos de patata más comunes y ubicuos, llegando a producir pérdidas considerables.
Estas bacterias se caracterizan por la producción de enzimas pectolíticos que degradan la pared celular de los tejidos e inducen lesiones en el tallo y podredumbres blandas del tubérculo.
Entre las especies mencionadas, P. chrysanthemi es la que presenta una temperatura óptima de crecimiento más elevada, por lo que las infecciones tienen consecuencias menos graves para la producción de patata en áreas geográficas templadas, pero pueden suponer un problema importante cuando los tubérculos madre con infecciones latentes se exportan a zonas más cálidas. En casos extremos se produce la muerte de la planta, aunque lo más frecuente es que ésta sobreviva y llegue a producir nuevos tubérculos, que también pueden estar infectados y ocasionar problemas durante su almacenamiento. Si las condiciones no son favorables para el desarrollo de la bacteria, ésta permanecerá latente y no se observarán síntomas. Sin embargo, si los tubérculos se conservan húmedos y no hay una ventilación adecuada se generan condiciones de anaerobiosis que favorecen la multiplicación del patógeno, originando pudriciones blandas que pueden llegar a ser muy severas en almacén.
A pesar de su presencia generalizada en cultivos de patata en otros países europeos, como Holanda y Francia, P. chrysanthemi no se encuentra ampliamente distribuida en este cultivo en España, aunque durante los últimos años se ha venido detectando esporádicamente en la Comunidad Valenciana (LÓPEZ y col., 1996), Aragón (PALACIO y col., 2004) y Andalucía Occidental (ANDUJAR y col., 2004). En este trabajo se describe la caracterización de 13 aislados españoles de P. chrysanthemi de patata mediante pruebas bioquímicas, serológicas y moleculares, y ensayos de patogenicidad. También se presenta el desarrollo de un nuevo sistema de microplacas para la identificación de biovares de P. chrysanthemi.
Materiales y métodos
Análisis de las muestras
Sintomatología en campo. Durante los meses junio y julio, se observaron síntomas similares a los descritos en infecciones de P. chrysanthemi en plantaciones comerciales de patata (cvs. ?Edzina?, ?Kondor? y ?Agria?) localizadas en Valencia y Teruel. Al principio, las plantas afectadas aparecían marchitas, especialmente durante las horas más calurosas del día, aunque parecían recuperarse al descender las temperaturas (Foto 1-A). En una fase temprana de la infección, se producía el marchitamiento de las hojas superiores, que posteriormente comenzaban a secarse por los márgenes hasta afectar finalmente a toda la hoja (Foto 1-B). La base del tallo presentaba un ligero oscurecimiento (Foto 1-C), asociado con lesiones necróticas de los vasos (Foto 1-D). En la fase más avanzada de la infección, la planta podía llegar a secarse completamente, quedando el tallo hueco debido a la necrosis de la médula (Foto 1-E).
Aislamientos. Las muestras de tejido de tallo afectado se machacaron en agua estéril. Las suspensiones se sembraron en medio selectivo Cristal Violeta Pectato (CVP) modificado (PÉROMBELON y BURNETT, 1991) y se incubaron 48-72 h a 27ºC.
Se seleccionaron para su caracterización colonias pectolíticas que producían cavidades en el medio selectivo.
Caracterización de los aislados
Los aislados se caracterizaron mediante análisis bioquímicos, serológicos y moleculares, y ensayos de patogenicidad. Se estudiaron 13 aislados obtenidos en plantaciones comerciales de Valencia y Teruel entre los años 1994 y 2003 (Tabla 1). En los análisis se incluyeron 2 cepas de referencia de P. chrysanthemi de patata procedentes de la Collection Française de Bactéries Phytopathógenes (CFBP) (Angers, Francia).
Identificación bioquímica. Se utilizaron métodos bacteriológicos convencionales para una primera identificación del género Pectobacterium, y se realizaron pruebas adicionales, para la diferenciación específica de P. chrysanthemi (COTHER y SIVASITHAMPARAM, 1983).
Identificación serológica. Se realizó mediante análisis ELISA, utilizando anticuerpos comerciales policlonales (LOEWE Phytodiagnostica) y monoclonales (Agdia).
Identificación molecular. Se realizó mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), utilizando los iniciadores específicos de P. chrysanthemi ADE1/ADE2 (NASSAR y col., 1996).
Ensayos de patogenicidad. Se utilizaron plan tas de los cultivares ?Agria? y ?Désirée? de 6 semanas de edad. Las inoculaciones se realizaron en el tallo, clavando una punta de micropipeta estéril que contenía 200 ?l de suspensión bacteriana (108 células/ ml) en agua destilada estéril. Las plantas testigo se inocularon con agua destilada estéril. Las plantas se mantuvieron a 28ºC y 100% de humedad relativa. Se observaron los síntomas durante 7 días y se realizaron aislamientos de las plantas inoculadas para confirmar la presencia de P. chrysanthemi.
Clasificación de los aislados de P. chrysanthemi en biovares
Se utilizaron las pruebas descritas por Ngwira y Samson (1990) para la identificación de biovares de P. chrysanthemi: crecimiento a 39ºC; hidrólisis de la arginina en anaerobiosis; asimilación de inulina en agua peptonada con rojo fenol. Otras fuentes de carbono: D(-) arabinosa, 5-cetogluconato, manitol, melibiosa, rafinosa y D(-) tartrato, se añadieron al 0.3% al medio base (AYERS y col., 1919) coloreado con azul de bromotimol.
Se utilizaron dos métodos: el método convencional, que se realiza en tubos de cultivo, y un nuevo método realizado en microplacas y basado en los descritos por Hayward y col. (1989) y Cubero y López (2001). En el método convencional se utilizaron 2 ml de los respectivos medios, añadiendo 50 ?l de las suspensiones bacterianas (108 células/ ml). En el sistema de microplacas, los diferentes medios (150 ?l) se dispensaron en las líneas horizontales de pocillos en microplacas de cultivo estériles (NuncTM Brand Products, Dinamarca), añadiendo 15 ?l de las suspensiones bacterianas en las líneas verticales. En todos los casos, se incluyeron como testigos las cepas de referencia CFBP 2015 (biovar 7) y CFBP 2288 (biovar 1). Las incubaciones se realizaron a 25ºC durante 72 h (microplacas), o durante 10 a 15 días (tubos).
Resultados
Los resultados de las pruebas bioquímicas serológicas y moleculares de los 13 aislados estudiados confirmaron la identificación de P. chrysanthemi.
Los aislados fueron patogénicos en plantas de patata, induciendo síntomas entre 2 y 7 días después de la inoculación. Los síntomas consistieron en una pudrición del tallo, produciendo en algunos casos un colapso rápido (2-3 días) del tallo y muerte de la planta (Foto 2). No se observaron síntomas de desecación de las hojas. No se detectaron diferencias en la expresión de síntomas entre los cultivares ?Agria? y ?Désirée?. Las plantas testigo no mostraron síntomas y los aislamientos realizados a partir de las plantas inoculadas confirmaron la presencia de P. chrysanthemi.
Se encontró una total coincidencia entre los resultados obtenidos mediante el sistema de microplacas (Fotos 3-A y 3-B) y el sistema convencional en tubos para la identificación de biovares. Los aislados españoles se clasificaron como biovares 1, 3, 5 y 6. Los resultados obtenidos para las cepas de referencia (biovares 1 y 7) fueron los esperados.
Discusión
La ausencia de síntomas de desecación, frente a una marcada pudrición de los tallos, se puede atribuir a las condiciones de elevada humedad relativa de los ensayos de inoculación, como señalan Lumb y col. (1986). Cabe destacar que los síntomas inducidos por los aislados españoles en campo durante los meses de verano, en condiciones ambientales de baja humedad relativa, coinciden con aquellos descritos en Israel (LUMB y col., 1986).
El nuevo sistema de microplacas, basado en aquellos descritos para la determinación de biovares de otras bacterias fitopatógenas, ha mostrado ser adecuado para la identificación de biovares de P. chrysanthemi. Este sistema ofrece una serie de ventajas frente al método convencional en tubos de cultivo: permite el análisis simultáneo de un elevado número de aislados y reduce considerablemente tanto el tiempo de incubación como la cantidad de medio necesario.
Entre los aislados españoles se han identificado los biovares 1, 3, 5 y 6. Diversos autores han descrito aislados de patata de los biovares 1 y 5 en Holanda, Francia y Suiza; del biovar 3 en Australia y Perú; y del biovar 6 en Taiwan. No se han encontrado referencias de aislados de patata de los biovares 3 y 6 en Europa, probablemente debido al reducido número de estudios disponibles sobre identificación de biovares de aislados de P. chrysanthemi de patata realizados durante los últimos años.
P. chrysanthemi fue identificado en cultivos de patata en España por primera vez en 1994 en Valencia.
Desde entonces, sólo se ha detectado en Andalucía Occidental y Aragón, de modo que el patógeno no se encuentra ampliamente distribuido en dicho cultivo. Estas observaciones sugieren que P. chrysanthemi sería un patógeno introducido recientemente a través de importaciones de patata de siembra con infecciones latentes. De acuerdo con Pérombelon (2002), las infecciones latentes de bacterias del género Pectobacterium son un fenómeno frecuente y ampliamente distribuido. La mayoría de las importaciones de patata de siembra proceden de Holanda y Francia, donde P. chrysanthemi está presente de forma generalizada. La presencia de P. chrysanthemi supone un riesgo de importantes pérdidas económicas, ya que esta bacteria puede adaptarse a condiciones de temperatura más elevadas que P. atrosepticum y P. carotovorum.
Este trabajo, junto con los resúmenes presentados en los Congresos VIII y XII de la Sociedad Española de Fitopatología (LÓPEZ y col., 1996; PALACIO- BIELSA y col., 2004), constituyen las primeras descripciones de las características de P. chrysanthemi aislada de patata en España.
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