Sección: 27as jornadas de productos fitosanitarios
Abstract: Se estudia, en condiciones controladas de laboratorio, la influencia de la actividad de agua (0.85-0.995 aw) y la temperatura (15 y 25ºC) en el crecimiento dual entre el agente de biocontrol Trichoderma harzianum y el hongo fitopatógeno causante de la podredumbre gris, Botrytis cinerea, a fin de conocer mejor qué condiciones son las que favorecen el desarrollo de la enfermedad (podredumbre gris), así como las más óptimas para que el agente de biocontrol actúe, y todo ello, para su posible aplicación práctica en cultivos controlados y al aire libre. Se observa un incremento significativo (P? 0.05) del crecimiento de T. harzianum y B. cinerea con la mayor disponibilidad de agua. En ambas cepas, el máximo desarrollo se alcanza a la aw de 0.995: B. cinerea cuando la temperatura es de 15ºC, y T. Harzianum de 25ºC. Mientras que en T. Harzianum se observan diferencias significativas (P? 0.05) entre las temperaturas ensayadas, no ocurre lo mismo en Botrytis cinerea, donde no parece que el factor temperatura afecte al crecimiento. Además, las tasas de crecimiento de T. Harzianum fueron superiores a las de B. cinerea cuando los ensayos se realizaron a 25ºC. Tanto a 15 como a 25ºC, el factor limitante del desarrollo de Botrytis cinerea, y por tanto el de la enfermedad, fue la disponibilidad de agua del medio, siendo las aw por encima de 0.90 las idóneas para el crecimiento de la cepa. También esas mismas condiciones de disponibilidad de agua, superiores a 0.90 de aw, y temperatura de 25ºC fueron las que favorecieron el desarrollo de la cepa seleccionada, Trichoderma harzianum, como agente de biocontrol. El que ambos agentes, patógeno y antagonista, muestren preferencias ecofisiológicas similares aumenta las posibilidades de Trichoderma harzianum como antagonista de Botrytis cinerea.
Botrytis cinerea es el agente causal de la podredumbre gris. Enfermedad muy común en los cultivos hortícolas protegidos y al aire libre del litoral mediterráneo. Es un hongo saprófito nato, y en ocasiones parásito accidental, que provoca daños y pérdidas económicas importantes en numerosos cultivos: fresa, alcachofas, judías, guisantes, tomate, berenjena, pimiento, etc, así como en frutas y hortalizas durante el almacenamiento y transporte si no se realizan correctamente (JARVIS, 1998; SÁEZ et al., 1998). La importancia de esta enfermedad no radica únicamente en su alta incidencia en los cultivos de invernadero, sino también en lo difícil que resulta, en la actualidad, su control, el cual se realiza casi exclusivamente con productos químicos.
Por ello, uno de los retos más importantes que debe afrontar, en un futuro próximo, la agricultura es la reducción del uso de productos químicos (fitosanitarios) para el control de plagas y enfermedades de las plantas, y sustituirlos, en la medida de lo posible, por otros sistemas de control disponibles más respetuosos con el medio ambiente.
El empleo racional de microorganismos antagonistas, entre ellos los hongos, bien por sí solos (control biológico o biocontrol) o conjuntamente con otros medios de lucha (Control Integrado) es ya un hecho constatado.
El primer paso para desarrollar una estrategia de control biológico de una enfermedad es identificar a los posibles antagonistas. Y para poder hacer uso práctico del mismo, es necesario que el antagonista se encuentre ecológicamente adaptado en el medio donde ha de actuar, establecerse en él, y competir y/o eliminar al patógeno (LARKIN Y FRAVEL, 1998; LANDA et al., 2001).
Existen muchísimos trabajos que demuestran el uso de los hongos (Trichoderma sp. Gliocladium sp., Myrothecium sp., Paecilomyces sp., Penicillium oxalicum) como agentes de biocontrol frente a las plagas y enfermedades de las plantas, por lo que se omitirá citarlos dada la extensa literatura al respecto. En cambio, para poder hacer uso práctico de los mismos, se necesita más información sobre cómo actúan los agentes de biocontrol, las características ecológicas del patógeno y antagonista, y las relaciones existentes entre antagonista-patógeno-huéspedmedio ambiente, es decir, incrementar los estudios sobre cuándo y dónde el agente de biocontrol es más probable que actúe eficientemente, y cuándo y dónde el patógeno puede ser suprimido para que no origine enfermedad. Determinar el momento, el lugar y las condiciones ambientales donde se deben de aplicar los agentes de biocontrol puede ser más importante que la cantidad a utilizar (LANDA et al., 2001).
En este trabajo se estudian "in vitro" algunos de los factores ecofisiológicos, que pueden afectar y condicionar la actividad de Trichoderma harzianum como agente de biocontrol de la podredumbre gris ocasionada por Botrytis cinerea, como la actividad de agua (aw) y temperatura, con el fin de conocer mejor qué condiciones favorecen el desarrollo de la enfermedad (podredumbre gris), así como las más favorables para el agente de biocontrol.
Material y métodos
Hongos
Las especies objeto de estudio son Trichoderma harzianum cepa 1010 (TH) y Botrytis cinerea (BC) CECT 2850.
La cepa TH fue aislada en nuestro laboratorio y actualmente se encuentra en fase de desarrollo comercial. La cepa BC 2850 fue cedida por la Colección Española de Cultivos Tipo (C.E.C.T.) y se aisló del bulbo del azafrán Ambas cepas fúngicas se mantuvieron en Agar Patata Glucosada (PDA).
Medio de cultivo y condiciones de los ensayos
El medio de cultivo utilizado para llevar a cabo todos los ensayos fue Agar Patata Glucosada (PDAm) con la aw modificada a 0.85, 0.90, 0.95, 0.98, y 0.995, con distintas cantidades de glicerol (ROSELLO et al., 2003). Se realizaron 10 tratamientos en los que se combinaron esas 5 aw y 2 temperaturas (15 y 25ºC).
Las cepas TH y BC se hicieron crecer en PDA a 25ºC, y a los 5 días se obtuvieron discos de la zona periférica de las colonias, que se depositaron en placas Petri con el medio PDAm para cada tratamiento. Ambas cepas, TH y BC, se enfrentaron a una distancia entre los puntos de inoculación de 4.4 cm. Todos los tratamientos se realizaron por duplicado, guardados en cajas herméticas de polietileno e incubados a dos temperaturas, a 15ºC y a 25ºC.
Efecto de la actividad de agua y la temperatura sobre el crecimiento de las colonias
El crecimiento fúngico se cuantificó midiendo el radio de la colonia sobre el medio de cultivo. Para cada colonia se dibujaron dos diámetros perpendiculares entre sí por la parte de detrás de la placa. Las medidas se tomaron diariamente durante el tiempo que duraron las experiencias.
Con los datos obtenidos se representó el crecimiento radial en función del tiempo, para cada una de las cepas enfrentadas a las condiciones de aw y temperaturas analizadas. Los datos se ajustan a una recta, calculándose a partir de aquí la velocidad de crecimiento en mm/día.
Se realizó el test de análisis de la varianza (ANOVA) para verificar la influencia de los factores simples analizados, aw y temperatura (T), sobre el crecimiento medio de las cepas, así como su interacción doble, aw x T.
Resultados y discusión
Efecto de la actividad de agua y la temperatura sobre el crecimiento de las colonias
En las Figuras 1 y 2 se observa que TH presenta una pauta de crecimiento similar a la obtenida en estudios precedentes, cuando se enfrentó esta misma cepa con distintos agentes fitopatógenos (SANTAMARINA et al., 2002; ROSELLÓ et al., 2003), creciendo en las dos temperaturas a las mismas aw, y con valores máximos de crecimiento a 0.995 aw y 25ºC. Valor máximo observado también por Kredics et al. (2004) en distintas especies de Trichoderma.
En BC, tanto a 15 como a 25ºC, se observa crecimiento a las aw de 0.95, 0.98 y 0.995 (Figuras 1 y 2). Por debajo de 0.95, al disminuir la actividad de agua también lo hace el crecimiento fúngico, siendo nulo a 0.85 y a 0.90; resultados que coinciden con los obtenidos por Frisvad y Samson (1991), que sitúan el crecimiento mínimo de BC entre 0.93 y 0.95 de aw. BC y TH crecen a las mismas aw, pero a diferencia de ésta última, BC presenta el mayor crecimiento cuando la temperatura es a 15ºC y la aw de 0.995, llegando a alcanzar valores de 11.22 mm/día.
En las dos especies, los valores máximos de crecimiento se obtienen para una aw de 0.995 (Figuras 1 y 2). Ahora bien, como se dijo anteriormente, el comportamiento entre las dos cepas es distinto, dependiendo de que la temperatura ensayada sea 15 o 25ºC. Mientras que en TH, a 25ºC y a las aw de 0.98 y 0.995, las tasas de crecimiento superan a las de BC (Figura 1), no se observa lo mismo cuando la temperatura desciende a 15ºC. A esta temperatura, BC se sitúa claramente por encima de TH (Figura 2), mostrando ratios de crecimiento bastante más altos. Esto nos confirma que las condiciones a 15ºC favorecen el desarrollo de BC, siendo a 25ºC las óptimas para TH.
Se observa que, en ambas cepas, e independientemente de la temperatura, hay un incremento significativo (P? 0.05) de las ratios de crecimiento para las distintas aw ensayadas (Tabla 1).
Se han obtenido diferencias significativas (P? 0.05) entre las medias de crecimiento de TH a 15ºC y las registradas a 25ºC, donde los valores han sido más grandes a ésta última temperatura. En cambio en BC, la temperatura no afecta significativamente (P? 0.05) al crecimiento medio de la cepa. No se aprecian, por tanto, diferencias entre una temperatura y la otra. A 15ºC los valores son algo inferiores que los obtenidos a 25ºC, excepto para una aw de 0.995 donde es ligeramente mayor el crecimiento a 15ºC con valores de 11.23 mm/día frente a los 10.43 mm/día registrados a 25ºC (Figuras 1 y 2). Estos resultados nos indican que el desarrollo de BC se ve favorecido cuando las temperaturas son más frescas y la disponibilidad de agua alta.
Conclusiones
En las condiciones de laboratorio estudiadas, se observa que, tanto a 15 como a 25ºC, el factor limitante del desarrollo de Botrytis cinerea, y por tanto el de la enfermedad, es la disponibilidad de agua del medio, siendo las aw por encima de 0.90 las idóneas para el crecimiento de dicha cepa. En cambio las condiciones más favorables para la cepa seleccionada, Trichoderma harzianum, como agente de biocontrol, son alta disponibilidad de agua, también superiores a 0.90 de aw y temperatura de 25ºC. El que ambos agentes, patógeno y antagonista, muestren preferencias ecofisiológicas similares aumenta las posibilidades de Trichoderma harzianum como antagonista de Botrytis cinerea.
BIBLIOGRAFÍA
FRISVAD, J. C.; SAMSON, R. A., 1991. Filamentous fungi in foods and feeds: Ecology, spoilage and mycotoxin production. En: Handbook of applied mycology. Vol. 3. Foods and deeds. Arora, D. A., Mukerji, D. K., Marth, E. H. (Eds.). Marcel Dekker. New York. pp 31-68.
JARVIS, W., 1998. Control de las enfermedades en cultivos de invernadero. Ediciones Mundi Prensa. Madrid.
KREDICS, L.; MANCZINGER, L.; ANTAL, Z.; PÉNZES, Z.; SZEKERES, A.; KEVEI, F.; NAGY, E., 2004. In vitro water activity and pH dependence of mycelial growth and extracelular enzyme activities of Trichoderma strains with biocontrol potential. Journal of Applied Microbiology 96, 491-498.
LANDA, B. B.; NAVAS-CORTÉS, J. A.; HERVAS, A.; JIMÉNEZ DÍAZ, R. M., 2001. Influence of rhizosphere bacteria, temperature and Fusarium oxysporum f. sp. ciceris inoculum density on suppression of Fusarium wilt of chickpea. Phytopathology 91: 807-816.
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ROSELLÓ, J.; ASENSI, C.; SANTAMARINA, M.P., 2003. Trichoderma harzianum: una solución a las enfermedades ocasionadas por Verticillium y Rhizoctonia. PHYTOMA España, 152: 9-16.
SÁEZ, E.; SÁNCHEZ, A.; TORRES, M., 1998. Plagas y enfermedades en cultivos hortícolas de la provincia de Almería: control racional. Consejería de Agricultura y Pesca. Junta de Andalucía. Sevilla.
SANTAMARINA, M. P.; ASENSI, C.; ROSELLÓ, J., 2002. Interacciones "in vitro" entre Trichoderma harzianum y Fusarium oxysporum fsp. lycopersici. PHYTOMA España, 144: 196-197.
