Sección: 27as jornadas de productos fitosanitarios
Abstract: Se determinó y comparó el efecto del metil-tiofanato sobre el crecimiento in vitro de Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici y de F. oxysporum. f. sp. radicis-lycopersici a diversas concentraciones de la materia activa: 0, 17.5, 35, 70 y 140 ppm. Las dos formas especiales se mostraron muy sensibles al tratamiento con dicho fungicida aunque Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici manifestaba una mayor inhibición del crecimiento. La DL50 para Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici fue de 61.32 ppm y para F. oxysporum. f. sp. radicis-lycopersici de 82.8 ppm.
De la amplificación de la región ITS del ADN ribosómico de ambas formas especiales mediante los iniciadores ITS1 y ITS4 se obtuvo una banda de 600 pb en ambos casos. La digestión con los enzimas de restricción nos permitieron obtener los siguientes fragmentos: de 380 pb, 120 pb y 100 pb con Hae III; de 430 pb y 170 pb con Alu I, de 260 pb, 175 pb, 100 pb y 75 pb con Taq I, mientras que Afa I no tiene ninguna diana de restricción en esta región.
Fusarium oxysporum Schlecht. causa marchitez por oclusión vascular en una gran cantidad de cultivos. Sin embargo existen cepas patogénicas individuales con un rango de huéspedes limitado y específico que se agrupan en las llamadas formas especiales. F. oxysporum Schlecht. f. sp. lycopersici (Sacc.) Snyder and Hansen (FOL) y F. oxysporum Schlecht. f. sp. radicis-lycopersici Jarvis et Shoem (FOLR) son las dos formas especiales de F. oxysporum que infectan específicamente al tomate (Lycopersicon esculentum L.).
Ambas formas no se distinguen morfológicamente pero sus diferencias se manifiestan en la fisiología y patogenicidad. Difieren principalmente en la forma de infectar a su huésped, en la temperatura óptima de desarrollo y en el nivel de afectación del tejido vascular de la planta (BENHAMOU y col. 1989). A nivel molecular se distinguen por la composición de las proteinas, de los ácidos grasos de la pared celular (MADOSINGH Y STARRAT, 1987, NADAL y col. 1995), tolerancia a la micostatina y composición de glúcidos de los microconidios (BOYER y col.1986).
FOL causa la marchitez del tomate, una de las enfermedades más frecuentes y graves de dicho cultivo. El hongo penetra por las raíces y coloniza los vasos, bloquea el transporte xilemático e impide el transporte de agua y sales minerales. La invasión del tejido vascular induce una marchitez severa del follaje seguida de achaparramiento de la planta, formación ocasional de raíces adventicias y finalmente puede llegar a provocar su muerte. (AGRIOS, 2001)
Una vez esta especie se ha establecido en un suelo es muy difícil erradicarla ya que se puede desarrollar saprofíticamente en ausencia del cultivo susceptible.
La forma especial FORL causa la enfermedad conocida como podredumbre de la corona y de la raíz. En este caso la oclusión del tejido vascular no afecta toda la planta. La marchitez inicial de las hojas se produce durante el día pero las plantas parecen recuperarse durante la noche.
Posteriormente las plantas infectadas pueden marchitarse de forma permanente y morir o sobrevivir muy debilitadas produciendo pocos frutos y de mala calidad. (ROBERTS y col. 2001).
Esta infección es difícil de controlar ya que el patógeno coloniza rápidamente el suelo esterilizado y puede persistir en el durante varios años.
Los tratamientos durante el ciclo del cultivo para ambas formas especiales son poco efectivos, sin embargo un control integrado incluyendo rotaciones, uso de variedades resistentes, control biológico, fumigación del suelo antes de la siembra y métodos culturales adecuados pueden reducir el impacto de estas enfermedades. (OZBAY y NEWMAN, 2004).
Dada la importancia que tiene el cultivo del tomate en las zonas templadas y la dificultad del control de estas enfermedades, el primer objetivo de este trabajo ha sido evaluar el efecto de diversas dosis del fungicida sistémico metil-tiofanato sobre FOL y FORL. Se intenta comprobar si esta materia activa utilizada frecuentemente para el control químico de F. oxysporum, tiene la misma eficacia contra las dos formas especiales.
Un segundo objetivo es determinar la sensibilidad de FOL y FORL al metil-tiofanato por PCR mediante la amplificación de la región ITS del ADN ribosómico (ADNr) de dichos hongos a partir del iniciador universal ITS4 combinado con ITS1 y digestión posterior con los enzimas de restricción Hae III, Afa I, Alu I y Taq I.
Materiales y métodos
En este estudio se usaron aislados de FOL (raza 1) y FORL mantenidos en la micoteca de la Facultad de Biologia de la Universitat de Barcelona.
Preparación de los medios de cultivo con fungicida
Para preparar las diversas concentraciones del fungicida se partió de una solución madre de 7.000 ppm. El medio de cultivo, Patata Dextrosa Agar [PDA, Difco] (39 g/l), se esterilizó a 120ºC durante 20 minutos y se dejó enfriar hasta 60ºC. A continuación se añadió la dosis correspondiente de la solución madre para obtener cada una de las concentraciones deseadas (0, 17.5, 35, 70 y 140 ppm) y se distribuyó en cápsulas de Petri de 90 mm de diámetro (JIMÉNEZ C., ALBARRACIN N.S. 1997).
Para la realización de la prueba se colocó un disco de 5 mm de diámetro de una colonia de FOL (raza 1) o de FORL en el centro de cada placa y se incubaron a oscuras a 24ºC durante 8 días. Se realizaron tres repeticiones con diez placas para cada concentración (un total de 30 placas/concentración).
El crecimiento de cada colonia se determinó a partir de la media de tres diámetros y a continuación se calcularon las medias de cada una de las concentraciones ensayadas. La recta de regresión se calculó relacionando los crecimientos medios de cada concentración con las dosis correspondientes a cada tasa de crecimiento. Substituyendo en la ecuación de la recta el valor de Y por la mitad del crecimiento del control se obtuvo la Dosis Letal Media (DL50).
Técnicas de caracterización molecular
La extracción de ADN del micelio de ambas formas especiales se realizó siguiendo el protocolo de un kit de aislamiento de DNA (Omega Biotek Inc.). Se incubaron unos 10 mg de micelio a 65ºC durante 5 minutos en un tubo de microcentrífuga con 600 ?l de FG1. Después de la incubación se adicionó 140 ?l de FG2, se agitó unos segundos en un vórtex y se centrifugó a 1.200 rpm durante 10 minutos; 600 ?l del sobrenadante se transfirieron en un nuevo tubo de microcentrífuga al cual se adicionaron 300 ?l de FG3 y 600 ?l de etanol absoluto. Después de agitar unos segundos, 800 ?l de la mezcla se dispusieron en una columna de extracción y se centrifugó a 1.200 rpm durante 1 minuto. Se eliminó el contenido del colector, se añadió el resto de la mezcla y se volvió a centrifugar (1 minuto).
A continuación se eliminó el colector con su contenido y se colocó la columna en un nuevo colector; seguidamente se añadieron 750 ?l de tampón de lavado (Wash Buffer) a la columna, se centrifugó de nuevo a 1.200 rpm. (1 minuto) y se eliminó el contenido del colector. Se añadieron 750 ?l del tampón y se repitió el mismo procedimiento. Para finalizar la extracción del ADN se centrifugó la columna a 1.200 rpm durante 1 minuto y se transfirió a un tubo de microcentrífuga.
Después se adicionaron 100 ?l de agua ultrapura bidestilada (Aldrich), se dejó reposar durante 1 minuto a temperatura ambiente y se centrifugó a 1.200 rpm (1 minuto).
La región ITS del ADN aislado (MCCARTNEY H.A.. y col. 2003) se amplificó mediante PCR (Reacción en cadena de la Polimerasa) a partir de1?l del ADN, 1?l de iniciador ITS1, 1?l de iniciador ITS4 y 22 ?l de agua ultrapura bidestilada.
Estos productos se transfirieron a tubos "PCR beads" (Amersham biosciences) que contenían BSA, dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 2.5 unidades de Taq polimerasa y tampón de reacción. El volumen final de 25 ?l corresponde a unas concentraciones de 200 mM de cada dNTP, 10 mM de tris-HCL, 50 mM de KCl y 1.5 mM de MgCl2. Las reacciones de la PCR se realizaron en un termociclador (Thechne Progene) programado para realizar una desnaturalización inicial de 5 minutos a 94ºC seguidos de 5 ciclos de 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 54ºC y 1 minuto a 72ºC. Continuaron 33 ciclos de desnaturalización (30 segundos a 94ºC), apareamiento (30 segundos a 48ºC), elongación (1 minuto a 72º) y por último un período final de extensión a 72ºC durante 10 minutos.
Una vez obtenidos los fragmentos de la región ITS del ADN ribosómico se analizaron mediante la técnica de ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis). Para ello 5 ?l de cada muestra se digirieron con las enzimas de restricción Hae III, Afa I, Alu I y Taq I siguiendo las recomendaciones específicas del producto (Invitrogen). Después de la digestión, la reacción se analizó por electroforesis en gel de agarosa al 2%, tampón TAE x1 y marcador de peso molecular ADN Ladder 100 pb (Life Technologies). Finalmente se hizo correr el ADN marcado con bromuro de etidio en una cubeta de electroforesis, se visualizaron las bandas mediante un transiluminador de UV y se fotografiaron.
Resultados
En las Tablas 1 y 2 se presentan los crecimientos de las colonias de ambas formas especiales a las distintas concentraciones ensayadas del fungicida.
El crecimiento medio diario de la placa control de FOL fue de 9.37 mm y se obtuvo la recta y = 8.483-0.062x con una r2 = 0.808 y una DL50 = 61.32 ppm de fungicida. El control de FORL presentó un crecimiento de 8.56 mm/día y la recta obtenida fue y = 7.221 - 0.035x con una r2 = 0.77 y una DL50 = 82.8 ppm de metil-tiofanato.
En la Figura 1 se puede observar que tanto FOL como FORL se mostraron sensibles al tratamiento con metil-tiofanato.
En las Figuras 2 y 3 se representan las rectas de regresión obtenidas al relacionar el crecimiento diario medio de la colonia con las correspondientes concentraciones de fungicida.
La distinta sensibilidad al metil-tiofanato no se tradujo en diferencias a nivel molecular entre las dos formas especiales para la región estudiada. Con la amplificación de la región ITS del ADN ribosómico (ADNr) mediante los iniciadores ITS1 y ITS4 se obtuvo una zona correspondiente a 600 pb en ambos casos. La posterior digestión con las enzimas de restricción (Hae III, Afa I, Alu I y Taq I) tampoco manifestó diferencias entre ambas formas especiales. Las bandas obtenidas por la digestión con Hae III fueron de 380 pb, 120 pb y 100 pb. Afa I no tiene ninguna diana de restricción en esta zona por lo que la banda aparecida era la correspondiente a la región ITS completa. Digiriendo con la enzima Alu I se obtuvieron dos bandas de 430 pb y 170 pb y con Taq I cuatro bandas de 260 pb, 175 pb, 100 y 75 pb (Figura 4).
Conclusiones
Los resultados de este ensayo indican que el metil-tiofanato es eficaz para inhibir el crecimiento tanto de FOL como de FORL aunque FOL se ha comportado como más sensible al tratamiento con dicha materia activa. Dada la dificultad de control de Fusarium spp. es recomendable la utilización del metil-tiofanato ya que actúa con eficacia a concentraciones relativamente bajas de materia activa.
La diferente sensibilidad de las dos formas especiales al producto ensayado no se traduce en diferencias en el ADNr de la región ITS. Por otra parte las pruebas moleculares muestran que la situación de las dianas para Hae III, Afa I, Alu I y Taq I es la misma en la región ITS de ambas formas de F. oxysporum.
En consecuencia no es posible determinar a priori la sensibilidad al metil-tiofanato mediante la digestión de la región ITS con los enzimas de restricción utilizados.
Con la técnica ARDRA se analiza una única región del genoma en la que no parece estar ubicado el gen responsable de la sensibilidad al metil-tiofanato; para este carácter pueden estar involucrados otros genes no analizados mediante esta técnica o genes cuyas variaciones no son detectables con las enzimas de restricción ensayadas.
BIBLIOGRAFÍA
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BENHAMOU, N., CHAREST, P and JARVIS, W. R., 1989. Biology and host-parasite relations of Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici. Vacular Wilt Disease of Plants, Basic Studies and Control. Springer-Verlag, Berlin Heidelberg: 95-106.
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