La transferencia de material genético desde especies silvestres, fundamentalmente del género Aegilops, a trigo cultivado se ha explotado ampliamente como una forma de introducir caracteres de interés agronómico, como resistencia frente a patógenos, en cultivares bien adaptados y altamente productivos. El objetivo actual de nuestro equipo de investigación, en colaboración con tres grupos pertenecientes al CSIC, Udl-IRTA y SIDT-Extremadura (ver reconocimientos), es obtener trigos resistentes al nematodo de quiste de los cereales, Heterodera avenae Woll., y al mosquito de trigo, Mayetiola destructor Say, mediante la introgresión de genes de resistencia (RGs) desde especies del género Aegilops. El uso de insecticidas y nematicidas presenta problemas sanitarios, ambientales y económicos, por lo que está comúnmente aceptado que la resistencia genética es un elemento esencial en el control de estos patógenos. Aunque ya han sido descritos e introducidos en trigo algunos genes de resistencia frente a estos patógenos, la aparición de nuevos patotipos/biotipos hace aconsejable la búsqueda de nuevas fuentes de resistencia en el propio trigo y en especies afines.
H. avenae, es un nematodo endoparásito sedentario formador de quistes y una de las especies patógenas más importantes para el cultivo de cereales, pudiendo provocar pérdidas de hasta el 50% en el rendimiento de la cosecha.
Esta especie está ampliamente distribuida en la mayoría de las áreas cerealistas del mundo, particularmente en Europa más del 50% de las áreas de cultivo están infestadas por este nematodo (RIVOAL Y COOK 1993). Los estudios realizados en España han demostrado la presencia de H. avenae en casi todas las áreas cerealistas, siendo el trigo (Triticum sp.) y la cebada (Hordeum vulgare L.) los cultivos más afectados (ROMERO y col. 1973). Hasta el momento se han descrito en trigo ocho genes (Cre1-Cre8) que confieren resistencia frente a H.avenae (MCINTOSH y col.1998-2003), de los que sólo Cre1 y Cre8 proceden del trigo y los seis restantes se han transferido desde especies de Aegilops. Los genes Cre2, Cre6 y Cre7 han sido transferidos desde Ae. ventricosa y Ae. Triuncialis por nuestro grupo, como se detallará a continuación. El gen Cre5 fue tambien transferido desde Ae. ventricosa a la línea de sustitución 6D(6Nv) (JAHIER y col. 1996).
M. destructor es un díptero de la familia Cecidomyiidae, cuyo hospedador principal es el trigo, aunque también puede serlo la cebada, el centeno y el triticale. En España fue descrito por primera vez a finales del siglo XIX (HERREROS 1896) y es causante de grandes pérdidas de producción en las principales zonascerealistas de la Península Ibérica (CASTAÑERA 1985). La Campiña Sur de Extremaduraes una comarca en la que el cultivo principal es el cereal (aproximadamente150.000 ha) y donde M. destructor parasita casi exclusivamente altrigo (DEL MORAL y col. 2002), llegando a producir pérdidas superiores al 35%.
Los sistemas de lucha directa con productos fitosanitarios no se utilizan de forma general al resultar costosos para el agricultor y no ser totalmente efectivos.
Por estas razones el método más eficaz de control ha sido la utilización de cultivares de trigo resistentes o tolerantes al insecto, sistema ampliamente utilizado en América del Norte y en Marruecos, donde esta plaga ha llegado a producir pérdidas próximas al 100%. Hasta la fecha, se han descrito 31 genes de resistencia, designados H1-H31 (MCINTOSH 1998-2003). Las fuentes de resistencia son básicamente especies de la tribu Triticeae, el propio trigo harinero, el trigo duro, así como el centeno. Los genes H27 y H30, como se comentará en el siguiente apartado, fueron transferidos a trigo hexaploide por nuestro grupo de investigación desde Ae. ventricosa y Ae. triuncialis, respectivamente.
Líneas de introgresión Trigo/Aegilops
En trabajos previos hemos demostrado la efectividad de una estrategia especial para transferir genes desde la especie silvestre Ae. ventricosa a trigo hexaploide (DOUSSINAULT y col. 1983, DELIBES y col. 1987). El cruzamiento utilizado en este estudio fue llevado a cabo por el Ingeniero Agrónomo M. Alonso Peña en los años sesenta y consistió en cruzar la especie donadora Ae. ventricosa (genomios DvDvNvNv) con Triticum turgidum (AABB), que actúa como especie puente, y polinizar el híbrido androestéril ABDvNv con la especie receptora T.aestivum (AABBDD). Después de repetidas autofecundaciones se obtuvieron 70 líneas estables (H-93), de 42 cromosomas, que llevaban incorporado material genético de Ae. ventricosa tanto por sustitución cromosómica como por recombinación.
Las líneas H-93 han sido caracterizadas mediante marcadores moleculares, métodos citológicos y ensayos de resistencia frente a enfermedades y plagas. Algunas líneas heredaron de su progenitor Aegilops resistencia a "oídio" y al "mal de pie" (DELIBES y col. 1987, DOUSSINAULT y col. 1983, MENA y col. 1992), así como las resistencias al nematodo del quiste y al mosquito del trigo, que se describirán en este artículo.
La línea H-93-8 (sustitución 5A/5Nv y 7D/7Nv) muestra un alto nivel de resistencia frente al patotipo Ha71 de H. avenae, que es el mayoritario en España.
Hemos demostrado que esa resistencia depende de un único gen dominante (Cre2) transferido desde el genomio Nv, y que confiere resistencia frente a otro patotipo español, cuatro franceses y uno inglés (MENA y col. 1993, DELIBES y col. 1993, 1996). Disponemos en este momento de dos marcadores de DNA para este gen (MONTES y col. 2003, MORENO y col., resultados no publicados).
El gen Cre6, caracterizado en colaboración con un grupo australiano, está localizado en el cromosoma 5Nv de las líneas H-93-8 y H-93-35 (sustitución 5D/5Nv), y confiere un alto nivel de resistencia frente al patotipo australiano Ha13 pero es ineficaz frente al español Ha71 (OGBONNAYA y col. 2001). Por último, habría que destacar la línea H-93-33 (sustitución 4D/4Nv), que posee altos niveles de resistencia frente a M. destructor conferida por un único gen dominante (H27), ligado al marcador isoenzimático Acph-Nv1, asociado con el cromosoma 4Nv (DELIBES y col. 1997).
Con objeto de verificar si el método de transferencia génica entre especies de distinta ploidía, utilizando una especie puente, podía generalizarse llevamos a cabo un cruzamiento similar utilizando las mismas especies puente y receptora pero Ae. triuncialis, (genomios UUCC) como especie donadora (ROMERO y col. 1998). El genomio C tiene la capacidad de suprimir el mecanismo de diploidización, lo que permite la recombinación entre los cromosomas de trigo y Aegilops, y con ello se puede conseguir minimizar el material genético foráneo transferido al trigo. Las líneas obtenidas (líneas TR) fueron caracterizadas de la misma forma que las líneas H-93. La línea TR-3531 de 42 cromosomas que, como era de esperar, no contiene cromosomas completos de Ae. triuncialis, aunque si fragmentos de los cromosomas 4U, 5U y 7U, posee altos niveles de resistencia frente a H. avenae y M. destructor. En ambos casos las resistencias fueron monogénicas y dominantes (genes Cre7 y H30). El gen Cre7 confiere resistencia frente a tres patotipos de H. avenae franceses, dos suecos y dos españoles (ROMERO y col. 1998). El gen que confiere resistencia a M. destructor, H30, ha podido ser ligado al marcador isoenzimático Acph-U1 (MARTÍN-SÁNCHEZ y col. 2003).
Un problema de la evaluación en campo de las resistencias son los "escapes" (genotipos susceptibles que se muestran como resistentes por no haberentrado en contacto con el patógeno). Para minimizar este problema se está tratandode utilizar la selección asistida por marcadores. Ninguno de los marcadoresque hemos descritos hasta el momento (isoenzimas, RAPDs, RFLPs, etc.),se encuentran estrechamente ligados a los RGs. Por todo ello, actualmente estamosdesarrollando estrategias alternativas basadas en las secuencias altamenteconservadas descritas dentro de los RGs de plantas (MEYERS y col. 1999, HAMMOND-KOSACK Y PARKER 2003) y en aquellos transposones presentes en el genomade las triticeas que se caracterizan por tener alto número de copias e inserciónpreferencial por zonas ricas en genes (KALENDAR y col. 2004).
Enzimas de desintoxicación
La resistencia a H. avenae conferida por los genes Cre2, Cre5 y Cre7 en las líneas H-93-8, 6D(6Nv) y TR-3531, respectivamente, está asociada a una cadena de sucesos temporales en la raíz que tienen lugar en respuesta al ataque por el patógeno. Esa cadena, que tiene por objeto bloquear el desarrollo del nematodo, supone incrementos de la actividad de peroxidasas específicas y otras enzimas relacionadas con el llamado "estrés oxidativo", deposición de lignina, muerte de las células huésped, etc. (ANDRÉS y col. 2001, MONTES y col. 2003 y 2004).
En la Figura 1 se muestra el procedimiento llevado a cabo para el estudio de los cambios de expresión, en respuesta al ataque de H. avenae, de tres sistemas isoenzimáticos relacionados con el estrés oxidativo [Peroxidasa (PER), Esterasa (EST) y Superoxido dismutasa (SOD)] en presencia y ausencia de los mencionados genes de resistencia. En los genotipos resistentes, con genes Cre2, Cre5 y Cre7, se detectaron notables cambios de actividad enzimática a partir de los 4 días de la inoculación en comparación con el testigo susceptible. En la Figura 2 se muestra, a título de ejemplo, los tres tipos de ensayo para el sistema PER de las tres líneas resistentes y un control susceptible. Los ensayos espectroscópicos (Figura 2A) en genotipos resistentes, muestran a los 7 días de la infección una notable sobre-inducción enzimática respecto a sus controles no infectados, que alcanza el máximo a los 11 días para luego decrecer. Esa inducción no es casi detectable en el control susceptible. Por isoelectroenfoque (Figura 2B), en el rango de pH mostrado, se puede observar la inducción de determinadas isoformas entre los puntos isoeléctricos 7,5 y 8,5. Estos cambios son similares, pero no idénticos, para todos los genes estudiados y prácticamente no detectables en el control. Para completar el estudio de enzimas relacionados con el estrés oxidativo, se aislaron mRNAs de fragmentos de raíz y se hibridaron con sondas de PER de trigo obtenidas por PCR. La Figura 2C muestra el resultado obtenido con la línea H-93-8 en la que se observa a los 4 días de la inoculación un aumento de la expresión de los genes PER en plantas infectadas frente al control no infectado. Ese aumento de expresión alcanza su máximo a los 7 días concordando con la secuencia temporal de los ensayos de actividad PER.
Aplicaciones prácticas
Junto a las investigaciones básicas descritas sobre genes de resistencia y defensa, este equipo está implicado así mismo en el desarrollo de líneas de trigo harinero que incorporen las mencionadas resistencias. Las líneas de introgresión resistentes, pero carentes de otras propiedades agronómicas, H-93-8 (gen Cre2), TR-3531 (genes Cre7 y H30) y H-93-33 (gen H27), han sido el punto de partida para introducir sus genes de resistencia en trigos de interés comercial, altamente productivos y/o de buena calidad mediante cruzamientos recurrentes por diferentes trigos de interés agronómico y selección por el método genealógico. En fases avanzadas del proceso, las líneas que en generaciones previas mostraron buen potencial por su resistencia o tolerancia frente al patógeno y/o su buen comportamiento agronómico, se sometieron a cuatro procesos paralelos:
1) Depuración espiga-surco y multiplicación de semilla para ensayos agronómicos.
2) Análisis de la resistencia al agente correspondiente en muestras diferentes.
3) Selección asistida por marcadores (MAS), en el caso de disponer de ellos.
4) Ensayos de evaluación de características agronómicas y de calidad.
Los primeros ensayos se realizaron en una o dos localidades y, con las líneas que superaron estos, se realizaron los ensayos "previos a registro" en varias localidades de Cataluña, Castilla-León Castilla-La Mancha y Andalucía, en comparación con testigos oficiales. Estos últimos han de ser homologados por la Oficina Española de Variedades Vegetales (OEVV) y posteriormente han de someterse a dos años de ensayos oficiales, controlados por la OEVV. Recientemente se ha solicitado la inclusión en los registros de Variedades Comerciales y de Variedades Protegidas, de dos líneas avanzadas con introgresión de Ae. ventricosa, la ID-2150 (tolerante a H. avenae) y Potenciano (ID-2151, tolerante a M. destructor) y una de Ae. triuncialis, la T-2003 (tolerante a H. avenae). En la Figura 3 se muestran, a título de ejemplo, las rectas de regresión de la línea T-2003 elaboradas con datos de producción de grano (Kg/ha), sobre un indicador de ambiente y comparándolas con las de dos testigos oficiales (variedades Anza y Soisson). Los datos de 8 ambientes diferentes (un ambiente equivale a un año-localidad) indican una superior producción de T-2003 respecto de los testigos tanto en ambientes favorables, como desfavorables. El nivel de resistencia de las tres líneas enviadas a Registro es inferior en todos los casos al de su parental Aegilops, fenómeno ampliamente descrito en la literatura cuando se transfieren RGs desde un nivel más bajo a uno más alto de ploidía. Las líneas se podrían considerar tolerantes, lo que significa que son capaces de sobrevivir y dar rendimientos satisfactorios a un nivel de infestación que causaría pérdidas económicas en trigos sin estos genes. Estas líneas presentan buenas características agronómicas, como resistencia a otros patógenos del trigo y mejor calidad harinera que los testigos frente a los que fueron evaluados.
Reconocimientos: Este trabajo se ha realizado en colaboración con otros tres grupos y con financiación dentro del marco de proyectos coordinados. En 1987 se estableció una colaboración con el CCMA del CSIC (IP: M.D. Romero Duque) y el Departamento de cereales del UdL-IRTA de Lérida (IP: J.M. Martín Sánchez) y fruto de esta colaboración son los Proyectos coordinados AGR89-0195-C03, AGF92-0062-C04, AGF95-093-1-C04, AGF98-1057-C04, AGL2001-3824-C04 y AGL2004-06791-C04. A partir del año 1992 se incorporó a este grupo el equipo del SIDT de Extremadura (IP: J del Moral), participando en los 5 últimos Proyectos y en un Proyecto PETRI (PTR95-0496-OP).
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