La defensa de la planta frente a los patógenos constituye un proceso multifactorial que incluye la inducción de las ?así llamadas- proteínas relacionadas con patogénesis (PRPs), la producción de fitoalexinas y de péptidos antimicrobianos, la generación de especies activas de oxígeno y la activación de un fenómeno de necrosis local inducida (reacción hipersensible). En general, se postula que este conjunto de factores da lugar a la producción de diversas sustancias tóxicas, las cuales son capaces de inhibir el crecimiento del patógeno. Por tanto, un patógeno "exitoso" tendrá que ser capaz de resistir o eludir a estos variados mecanismos de defensa vegetales.
No obstante, todavía quedan algunas preguntas por contestar. Por ejemplo ¿cuál es la contribución relativa de los diferentes mecanismos de defensa en una interacción planta-patógeno particular? Nosotros hemos tratado de abordar esta cuestión mediante la identificación y caracterización de cepas mutantes de bacterias fitopatógenas que presentan una mayor sensibilidad a algunos de estos factores de defensa del huésped. El estudio detallado de la virulencia de estos mutantes nos permite realizar una ?disección molecular? del proceso de defensa de las plantas. En particular, nos hemos centrado en la resistencia bacteriana a tres tipos de factores: los péptidos antimicrobianos, el estrés oxidativo y el pH ácido.
Resistencia a péptidos antimicrobianos
Los péptidos antimicrobianos forman una parte esencial de la denominada inmunidad innata, un mecanismo de defensa no específico que está presente tanto en plantas como animales. Varias familias de estos péptidos han sido descritas en ambos reinos (BOMAN, 1995; GARCÍA-OLMEDO et al., 1998), tales como tioninas, defensinas y snakins. El papel defensivo de estas sustancias puede evaluarse estudiando mutantes bacterianos con sensibilidad incrementada a los mismos. Esta hipótesis se ha visto apoyada por el descubrimiento de que mutantes de Ralstonia solanasearum sensibles a tioninas resultan no-patogénicos en plantas de tabaco (TITARENKO et al., 1997).
El análisis de los mutantes sap (sensitive to antimicrobial peptides) de Salmonella typhimurium ha propiciado el descubrimiento de los genes sapA-sapF,implicados en la virulencia de esta bacteria en el ratón y en la resistencia a péptidosantimicrobianos animales (PARRA-LÓPEZ et al., 1993). Estos genes están organizadosen un operón único y tienen una clara similitud de secuencia contransportadores de tipo ABC descritos en otras especies. El mecanismo de acciónpropuesto para este sistema incluye la unión entre el componente periplásmico sapA y el péptido diana, seguido de la internalización de dicho péptido,donde se produciría su degradación y/o la activación de otros mecanismosde defensa. En nuestro grupo, hemos investigado el papel del operón sap en labacteria fitopatógena Erwinia chrysanthemi, agente causal de la podredumbrebacteriana de los vegetales, que es una enfermedad de considerable importanciaeconómica en muchos países y que afecta a numerosas especies de plantascultivadas.
El operón sapA-sapF de Erwinia chrysanthemi contiene 5 genes y muestra una notable conservación a nivel de secuencia y organización con el operón homólogo de Salmonella. Dichos genes se clonaron y se construyó un mutante, mediante deleción e inserción de un interposón, seguida de "intercambio de marcadores" sobre la cepa silvestre; el mutante resultó ser más sensible a a-tionina de trigo y a snakin (uno de los péptidos antimicrobianos mayoritarios en tubérculo de patata (SEGURA et al., 1999)). Este mutante también resultó ser menos virulento en patata, siendo su capacidad de causar necrosis en este tejido equivalente a un 37% de la cepa silvestre. En experimentos donde se medía la capacidad de establecer una población bacteriana en la planta, el número de células de bacteria fue de dos órdenes de magnitud inferior al que alcanzaba la cepa silvestre. Estos resultados indican que la interacción entre los péptidos antimicrobianos del hospedador con el operón sapA-F del patógeno juega un papel similar en patógenos de plantas y animales (LÓPEZ-SOLANILLA et al., 1998).
Con objeto de profundizar en este asunto, construimos un conjunto de mutaciones combinatorias entre sapA-F y otros genes que se sabía que eran determinantes de la virulencia de esta bacteria: el operón pelA-E, que codifica las pectato liasas capaces de degradar la pared celular de la planta, y el sistema Hrp, que codifica un sistema de secreción de tipo III, capaz de introducir proteína efectoras en la célula de hospedador (BAUER et al., 1994). La serie completa de mutantes simples, dobles y triple en estos sistemas fue sometida a experimentos detallados para medir su virulencia (área necrótica y población bacteriana) en diversos hospedadores. La conclusión más importante fue que el operón sap parece tener una importancia mucho mayor en la virulencia que los otros dos sistemas.
Una forma alternativa para abordar el estudio del papel de este sistema en patogénesis consiste en comparar la capacidad de crecimiento "en planta" entre un mutante y el silvestre, en series de experimentos de co-inoculación en las que se varía la proporción de inóculos. Esto permite hacer estimaciones de los índices de competitividad "en planta" y en "medio de cultivo" de los diferentes mutantes, lo que a su vez nos informa de la importancia que tienen los correspondientes genes en el proceso de patogénesis. En estos ensayos, los mutantes pel y sap mostraron bajos índices de competitividad en planta, pero no en medio de cultivo, mientras que el mutante hrp resultó ser indistinguible del silvestre en ambas condiciones (LÓPEZ-SOLANILLA ET AL., 2001).
Resistencia a estrés oxidativo
Otro de los mecanismos conocidos de defensa en plantas es la ocurrencia de un "choque oxidativo" inducido por la presencia del patógeno, que consiste en la producción de diversas especies activas de oxígeno (EAO). Se ha postulado que dichas sustancias podrían jugar un papel dual en defensa; por un lado, podrían ejercer un efecto antimicrobiano directo sobre el patógeno, y por otro, podrían actuar indirectamente como activadores de otros elementos de defensa.
Por ejemplo, en la lignificación de las paredes celulares o en la inducción de fitoalexinas (BAKER AND ORLANDI, 1995). A pesar de que el efecto antimicrobiano in vitro del O2 - y del H2O2 ha sido descrito hace bastante tiempo (DOKE, 1987), no existe una evidencia concluyente con respecto a su posible papel antimicrobiano en planta. Dicha hipótesis, la del efecto antimicrobiano directo, tiene como corolario que las bacterias fitopatógenas deberían ser capaces de resistir los efectos de EAOs para poder multiplicarse en tejidos vegetales.
En enterobacteriáceas se ha descrito que la expresión de un buen número de enzimas implicadas en la detoxificación de EAO, incluyendo catalasas, peroxidasas y glutation reductasa, está regulada por el producto del gen oxyR, un miembro de la familia de activadores transcripcionales LysR. Como cabe esperar, las cepas mutantes en este gen regulador presentan una acusada sensibilidad a estrés oxidativo. Con estos antecedentes, decidimos contrastar la hipótesis del posible papel antimicrobiano directo de las EAO en defensa vegetal, construyendo y analizando el mutante de oxyR de Erwinia chrysanthemi (MIGUELet al., 2000). Encontramos que el gen oxyR de esta bacteria tenía una similitud de secuencia de 88% (en aminoácidos) con el correspondiente en E. coli. El mutante de E. chrysanthemi tenía menores niveles de catalasas, peroxidasas y otras enzimas relacionadas y (tal como se esperaba) mayor sensibilidad a estrés oxidativo. Además, dicho mutante era incapaz de formar colonias individuales en medio sólido, a menos que se añadiese catalasa exógena; este fenotipo se había descrito en otros mutantes oxyR de enterobacteriáceas, y se explicaba asumiendo que el nivel de estrés oxidativo al que se ven sometidas las células bacterianas individuales en la placa de agar resulta excesivo para el mutante. Sin embargo, el mutante oxyR de E. chrysanthemi resultó ser indistinguible del silvestre en cuanto a su virulencia, en tubérculo de patata y en hojas de endivia, tabaco y arabidopsis. Esto implica que el crecimiento dentro de la planta ?rescata? el fenotipo del mutante, lo cual contradice la hipótesis del efecto antimicrobiano directo de las EAO durante la defensa de la planta. Ello no excluye que las EAO, y en particular el H2O2 tenga un papel importante en señalización, pero probablemente estas sustancias son degradas con rapidez , debida a la acción combinada de enzimas y sustancias anti-oxidantes, por lo que no pueden acumularse en cantidades suficientes para ejercer un efecto sobre las células bacterianas (MIGUEL et al., 2000).
Resistencia a pH ácido
El apoplasto es un medio moderadamente ácido cuyos valores de pH oscilan entre 5.0 y 6.5 (GRIGNON AND SENTENAC, 1991). Además de a la concentración de protones (efecto pH) las bacterias se enfrentan a los efectos de ácidos orgánicos presentes en los tejidos vegetales. En los últimos años ha habido un gran progreso en el conocimiento de los mecanismos de adaptación a pH ácido en las enterobacteriaceas. Valores de pH bajos en el medio extracelular provocan una disminución del pH intracelular debido a la difusión pasiva de protones a través de la membrana citoplásmica. La disminución de los valores de pH en el interior celular conlleva, entre otros, la activación de la expresión de genes que codifican descarboxilasas de aminoácidos que contribuyen a la elevación del pH a través de la catálisis de reacciones que consumen protones (BEARSONet al., 1997). Los nuevos productos formados se intercambian por un nuevo sustrato mediante mecanismos de tipo antiporter. Estas condiciones inducen también la acumulación de al menos dos factores de transcripción: RpoS y PhoP.
Estos reguladores controlan distintos grupos de genes implicados en la protección y reparación de macromoléculas. En S. typhimurium se ha descrito también un mecanismo de adaptación a la acción antimicrobiana de ácidos grasos de cadena corta (KWON AND RICKE, 1998).
En Salmonella se ha descrito un mecanismo de tolerancia a ácido basado en que el crecimiento a valores de pH moderadamente ácido induce la síntesis de proteínas específicas que protegerán a las células frente a valores de pH extremadamente ácidos (FOSTER AND HALL, 1990). Este fenómeno ha sido estudiado en E. chrysanthemi y se ha comprobado que esta bacteria no dispone de la capacidad de adaptación descrita en Salmonella (LLAMA-PALACIOS y col., datos no publicados).
El estudio de la respuesta a pH ácido en E. chrysanthemi que actualmente se está desarrollando en nuestro grupo ha permitido la caracterización de un sistema de regulación de dos componentes denominado PhoP-PhoQ (LLAMA-PALACIOSet al., 2005) homólogo al descrito en otras enterobacteriaceas como S.typhimurium (GROISMAN et al., 1989; MILLER et al., 1989). Este sistema ha sido descrito en Salmonella como un factor clave que controla la virulencia a través de la regulación de alrededor de 40 genes entre los que se incluyen proteasas, fosfatasas y transporatadores de cationes (ERNST et al., 2001). PhoQ es un sensor histidin-quinasa que tras detectar diferentes condiciones se autofosforila y transfiere, tras un cambio conformacional, el grupo fosfato a PhoP que es un regulador transcripcional (MARINA et al., 2001). Este regulador controla positivamente la expresión de un conjunto de genes denominados pag (phoP-activated genes) y negativamente los denominados prg (phoP-repressed genes). La función de estos genes es esencial para la virulencia de la bacteria ya que están implicados en procesos como la supervivencia en macrófagos, la supervivencia a pH ácido y la resistencia a péptidos antimicrobianos (FIELDS et al., 1989; MILLER AND MEKALANOS, 1990; BEARSON et al., 1998). En E. chrysanthemi el mutante afectado en este sistema es incapaz de crecer a pH ? 5.5 y su nivel de supervivencia disminuye drásticamente respecto del de la cepa silvestre. Este mutante es sensible a péptidos antimicrobianos, está afectado en la producción de enzimas pectolíticas, y su virulencia es significativamente inferior a la de la cepa silvestre en distintos huéspedes (LLAMA-PALACIOS et al., 2003). En E. carotovora también se ha descrito este sistema y se ha relacionado con la regulación de enzimas pectolíticas (FLEGO et al., 2000).
Agradecimientos. Este trabajo ha sido financiado por el Proyecto AGL-2002-01412 del Ministerio de Educación y Ciencia.
BIBLIOGRAFÍA
BAKER, J.C., AND ORLANDI, E.W. (1995). Active oxygen in plant pathogenesis. Annu. Rev. Phytopathol. 33, 299-321.
BAUER, D.W., BOGDANOVE, A.J., BEER, S.V., AND COLLMER, A. (1994). Erwinia chrysanthemi hrp genes and their involvement in soft rot pathogenesis and elicitation of the hypersensitive response. Mol. Plant-Microbe Interact. 7, 573-581.
BEARSON, B.L., WILSON, L., AND FOSTER, J.W. (1998). A low pH-inducible, PhoPQ-dependent acid tolerance response protects Salmonella typhimurium against inorganic acid stress. J. Bacteriol. 180, 2409-2417.
BEARSON, S., BEARSON, B., AND FOSTER, J.W. (1997). Acid stress responses in enterobacteria. FEMS Microbiol. Lett. 147, 173-180.
BOMAN, H.G. (1995). Peptide antibiotics and their role in innate immunity. Annu. Rev. Immunol. 13, 61-92.
DOKE, N. (1987). Release of Ca2+ bound to plasma membrane in potato tuber tissue cells in the initiation of hypersensitive reaction. Ann. Phytopathol. Soc. Jpn. 53, 391.
ERNST, R.K., GUINA, T., AND MILLER, S.I. (2001). Salmonella typhimurium outer membrane remodeling: role in resistance to host innate immunity. Microbes Infect. 3, 1327-1334.
FIELDS, P.I., GROISMAN, E.A., AND HEFFRON, F. (1989). A Salmonella locus that controls resistance to microbicidal proteins from phagocytic cells. Science 243, 1059-1062.
FLEGO, D., MARITS, R., ERIKSSON, A.R., KOIV, V., KARLSSON, M.B., HEIKINHEIMO, R., AND PALVA, E.T. (2000). A two-component regulatory system, pehR-pehS, controls endopolygalacturonase production and virulence in the plant pathogen Erwinia carotovora subsp. carotovora. Mol. Plant-Microbe Interact. 13, 447-455.
FOSTER, J.W., AND HALL, H.K. (1990). Adaptive acidification tolerance response of Salmonella typhimurium. J. Bacteriol. 172, 771-778.
GARCÍA-OLMEDO, F., MOLINA, A., ALAMILLO, J.M., AND RODRÍGUEZ-PALENZUELA, P. (1998). Plant defense peptides. Biopolymers 47, 479-491.
GRIGNON, C., AND SENTENAC, H. (1991). pH and ionic conditions in the apoplast. Annu. Rev. Plant Physiol 42, 103-128.
GROISMAN, E.A., CHIAO, E., LIPPS, C.J., AND HEFFRON, F. (1989). Salmonella typhimurium phoP virulence gene is a transcriptional regulator. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 7077-7081.
KWON, Y.M., AND RICKE, S.C. (1998). Induction of acid resistance of Salmonella typhimurium by exposure to short-chain fatty acids. Appl. Environ. Microbiol. 64, 3458-3463.
LLAMA-PALACIOS, A., LÓPEZ-SOLANILLA, E., AND RODRÍGUEZ-PALENZUELA, P. (2005). Role of the PhoP-PhoQ system in the virulence of Erwinia chrysanthemi strain 3937: involvement in sensitivity to plant antimicrobial peptides, survival at acid Hh, and regulation of pectolytic enzymes. J. Bacteriol. 187, 2157-2162.
LLAMA-PALACIOS, A., LÓPEZ-SOLANILLA, E., POZA-CARRIÓN, C., GARCÍA-OLMEDO, F., AND RODRÍGUEZ-PALENZUELA, P. (2003). The Erwinia chrysanthemi phoP-phoQ operon plays an important role in growth at low pH, virulence and bacterial survival in plant tissue. Mol. Microbiol. 49, 347-357.
LÓPEZ-SOLANILLA, E., GARCÍA-OLMEDO, F., AND RODRÍGUEZ-PALENZUELA, P. (1998). Inactivation of the sapA to sapF locus of Erwinia chrysanthemi reveals common features in plant and animal bacterial pathogenesis. Plant Cell 10, 917-924.
LÓPEZ-SOLANILLA, E., LLAMA-PALACIOS, A., COLLMER, A., GARCÍA-OLMEDO, F., AND RODRÍGUEZ-PALENZUELA, P. (2001). Relative effects on virulence of mutations in the sap, pel, and hrp loci of Erwinia chrysanthemi. Mol. Plant-Microbe Interact. 14, 386-393.
MARINA, A., MOTT, C., AUYZENBERG, A., HENDRICKSON, W.A., AND WALDBURGER, C.D. (2001). Structural and mutational analysis of the PhoQ histidine kinase catalytic domain. Insight into the reaction mechanism. J. Biol. Chem. 276, 41182-41190.
MIGUEL, E., POZA-CARRIÓN, C., LÓPEZ-SOLANILLA, E., AGUILAR, I., LLAMA-PALACIOS, A., GARCÍA-OLMEDO, F., AND RODRÍGUEZ-PALENZUELA, P. (2000). Evidence against a direct antimicrobial role of H2O2 in the infection of plants by Erwinia chrysanthemi. Mol. Plant-Microbe Interact. 13, 421-429.
MILLER, S.I., AND MEKALANOS, J.J. (1990). Constitutive expression of the phoP regulon attenuates Salmonella virulence and survival within macrophages. J. Bacteriol. 172, 2485-2490.
MILLER, S.I., KUKRAL, A.M., AND MEKALANOS, J.J. (1989). A two-component regulatory system (phoP phoQ) controls Salmonella typhimurium virulence. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 5054-5058.
PARRA-LÓPEZ, C., BAER, M.T., AND E.A., G. (1993). Molecular genetic analysis of a locus required for resistance to antimicrobial peptides in Salmonella typhimurium. EMBO J. 12, 4053-4062.
SEGURA, A., MORENO, M., MADUEÑO, F., MOLINA, A., AND GARCÍA-OLMEDO, F. (1999). Snakin-1, a peptide from potato that is active against plant pathogens. Mol. Plant-Microbe Interact. 12, 16-23.
TITARENKO, E., LÓPEZ-SOLANILLA, E., GARCÍA-OLMEDO, F., AND RODRÍGUEZ-PALENZUELA, P. (1997). Mutants of Ralstonia (Pseudomonas) solanacearum sensitive to antimicrobial peptides are altered in their lipopolysaccharide structure and are avirulent in tobacco. J. Bacteriol. 179, 6699-6704.
