Una de las principales causas responsables de la dispersión de la Fusariosis vascular del melón (Cucumis melo), causada por el agente patógeno Fusarium oxysporum f. sp. melonis, es la reutilización de las bandejas de alvéolos empleadas por los productores de plántulas. Con los ensayos realizados, aplicando al inóculo de dicho patógeno la energía producida por un microondas comercial de 2.45 GHz de frecuencia, los autores han demostrado que, con esta técnica, es posible la erradicación total del hongo de las bandejas de poliuretano expandido utilizadas en la producción comercial de plantas, lo cual, además de ser un método novedoso y atractivo para la erradicación de este patógeno, constituye un proceso inocuo, no destructivo, rápido, compacto, de elevada velocidad de puesta en funcionamiento y parada, no contaminante del medio ambiente, y con ausencia de peligros tanto para los manipuladores, como para los posteriores usuarios.
INTRODUCCIÓN
La Fusariosis del melón, causada por el agente patógeno Fusarium oxysporum Schlecht f. sp. melonis Snaider and Hansen (Fom), es una de las más destructivas enfermedades que se presentan en todas las regiones productoras de este cultivo y, cuando aparece, es capaz de reducir la producción incluso por encima del 90% (4,7,9,11, 14).
En Castilla-La Mancha, que representa una de las mayores áreas del mundo de cultivo de melón al aire libre, la mayoría de los agricultores, debido al elevado precio de la semilla, realiza la implantación del cultivo mediante el trasplante de plántulas enraizadas en cámaras de ambiente controlado por viveristas especializados, utilizando para ello bandejas de poliuretano expandido. Normalmente, dichas bandejas tienen dimensiones de 70 x 46 x 7,5 cm y tienen 216 alvéolos de 12 ml de capacidad cada uno. En ellos los viveristas colocan para su enraízamiento, una a una, las semillas de melón, en un sustrato de turba. Para evitar la evaporación y favorecer la nascencia, una vez sembrada cada semilla en su alvéolo correspondiente, es usual cubrirlo el sustrato con una delgada capa de vermiculita.
Aunque la forma normal de combatir esta enfermedad es la prevención del patógeno en el terreno (17), la reutilización de dichas bandejas que contienen restos de sustrato infestado, es una de las principales causas responsables de la rápida dispersión de esta enfermedad. Así ocurre también en patógenos similares (1). La lucha contra esta enfermedad en cultivares no resistentes implica la utilización de semillas y de plántulas exentas del patógeno, lo que exige el uso de semilla sana y la erradicación del patógeno del sustrato y de la bandeja de propagación (5).
Los métodos químicos, como la aplicación de desinfestantes como el hipoclorito sódico o el formol, producen serios problemas de fitotoxicidad en las jóvenes plantas, así como riesgos para el manipulador, para los posteriores usuarios y para el medio ambiente. Los métodos físicos, como el calentamiento convencional, además de ser voluminosos, difíciles de manejar y de contaminar el medio ambiente (12), no son aplicables a las bandejas de propagación. La solarización, aunque permite reducir la viabilidad del patógeno, como depende tanto de la temperatura como del tiempo, el cual, a 60ºC, es de 6 a 8 semanas en la época estival, tampoco es aplicable (17).
Aunque son numerosos los autores que coinciden en que la mayor desventaja de uso de microondas, cuando se aplica a la desinfestación del suelo, es su elevado precio, ya que requiere gran cantidad de energía, sobre todo cuando la humedad del terreno es alta (2, 8, 11, 13, 16), basándose en que estudios de laboratorio y ensayos de campo han mostrado que la energía aplicada mediante ondas de ultra alta frecuencia (microondas) es destructiva para un amplio espectro de parásitos de suelo y de semillas (3, 6, 10, 12, 15), y en que, en el caso de la desinfestación del material utilizado en la propagación de semillas de melón, se trata de pequeñas cantidades de suelo y de material transparente a las microondas, ha sido por lo que, los autores de este trabajo, han utilizado las ondas de frecuencia de 2.45 GHz producidas por un horno microondas convencional, para erradicar el inóculo de Fusarium oxyxporum f. sp melonis durante el proceso de producción comercial de plántulas de melón y así evitar su dispersión en campo. Para demostrarlo han realizado ensayos con un microondas comercial, aplicando diferentes cantidades de energía a inóculo del patógeno suspendido en agua esterilizada. Con estas suspensiones inocularon por inmersión las raíces de plántulas de melón "Amarillo Canario", propagadas con una asepsia total y en ellas estudiaron la Curva de Progreso de la Enfermedad.
Materiales y métodos Material vegetal
Las semillas de melón utilizadas en los ensayos eran del cv. Amarillo Canario, variedad escogida por ser susceptible a todas las razas de Fom (20). Las semillas se desinfestaron superficialmente sumergiéndolas 2 minutos en hipoclorito sódico al 10%. A continuación se pusieron a germinar en placas Petri que contenían vermiculita estéril, las cuales se colocaron en cámara de crecimiento a 25±2ºC, 75% de humedad relativa y 16 horas/día de fotoperiodo con luz fluorescente (450 ?E.m-2.s-1). Las semillas que habían germinado se trasplantaron una a una a los alvéolos de minibandejas de 10 alvéolos cada una, cortados de bandejas comerciales que nunca habían sido utilizadas, que contenían una mezcla de turba negra y turba rubia (70:30, v:v) previamente esterilizada en autoclave a 120ºC (1 atm) durante una hora, dos días consecutivos. Una vez sembradas se cubrían los alvéolos con una ligera capa de vermiculita estéril para reducir la evaporación y favorecer la nascencia y se mantuvieron, regándolas cada dos días a capacidad de campo, en la cámara de crecimiento en las mismas condiciones anteriores.
Incremento del inóculo
El patógeno utilizado fue un aislado de Fusarium oxysporum f. sp. melonis raza 2, que había sido aislado de plantas enfermas procedentes de una parcela comercial de melón de la provincia de Ciudad Real (España). Del borde de la colonia de cultivos monospóricos del patógeno de 6 días, se extrajeron discos de micelio de 5 mm de diámetro, cinco de los cuales fueron introducidos en matraces Erlenmeyer que contenía 100 mililitros de caldo patata-dextrosa (CPD), los cuales fueron incubados en un agitador orbital, a 120 rpm, a 25ºC de temperatura y 16 horas/día de luz fluorescente (450 ?mol E. m-2.s-1). A los 6 días, el contenido de los matraces se filtró a través de 8 capas de gasa estéril, ajustándose la suspensión de microconidias a una concentración de 5.106 conidias/ml.
Tratamiento con microondas
Todos los ensayos se realizaron con un horno microondas convencional (DAEWOO KOC-970T) de 1.400 vatios de potencia nominal y 1.000 vatios de potencia de salida, que trabaja a 2.45 GHz y produce las microondas mediante un magnetrón alimentado por un transformador de 220 voltios de entrada y 4.000 voltios de salida. El magnetrón envía las ondas al interior de un receptáculo en forma de paralelepípedo de 34 x 24 x 33 cm de longitud, construido en acero inoxidable, cerrado con una puerta con aislante de doble capa de vidrio y filtro. Las ondas son enviadas al interior del receptáculo mediante una campana conductora colocada en una de sus caras laterales. Dicho horno está provisto de un sistema digital de control que permite aplicar la irradiación producida por el magnetrón con intérvalos de un segundo. Teniendo en cuenta la masa a irradiar, se estableció, según trabajos anteriores (18,19), que las energías más adecuadas a aplicar eran de 1.000, 3.000, 6.000, 9.000, 12.000, 15.000,18.000, 21.000, 24.000, 27.000 y 30.000 Julios. Diez militros de suspensiones conídicas de Fusarium oxyxporum f.sp. melonis con una concentración de 5.106 conidias/ ml, fueron dispensados en 66 frascos estériles de 20 ml, los cuales fueron dispuestos en once bloques de 6 frascos/bloque en el plato del microondas, en posiciones fijas, y a cada uno de los bloques le fue aplicada una de las once cantidades de energía seleccionadas.
Inoculación de las plantas
Las plántulas de melón de 7 días, en las que habían emergido las primeras hojas verdaderas, se sacaron cuidadosamente de los alvéolos y se lavaron sus raíces con agua corriente, eliminando todos los restos de sustrato. Once grupos formados por 4 bloques de 10 plántulas/bloque fueron inoculados sumergiendo respectivamente sus raíces en once suspensiones de 60 ml con una concentración de 5.106 conidias/ml de Fusarium oxysporum f. sp. melonis, las cuales habían sido irradiadas cada una con una de las once energías seleccionadas. Las plántulas de los once grupos de 4 bloques de 10 plántulas/bloque, una vez inoculadas, fueron trasplantadas individualmente a contenedores de plástico de 250 cm3 de capacidad, rellenos de sustrato esterilizado. Como plantas testigo se utilizaron 4 bloques de 10 plántulas/bloque, cuyas raíces se sumergieron en 60 cm3 de suspensión de inóculo con una concentración de 5.106 conidias/ml que no había sido irradiada con microondas. Como control sin inocular se utilizaron 4 bloques de 10 plántulas/bloque, cuyas raíces se sumergieron en agua esterilizada.
Tanto las plantas testigo, como las plantas control, se trasplantaron a sus respectivos contenedores, idénticos a los anteriores y rellenos del mismo sustrato esterilizado. Todos los bloques de plantas fueron mantenidos, para evitar contaminaciones, en bandejas independientes, en una cámara de crecimiento durante 22 días, a 25ºC, con 16 horas de fotoperiodo con luz fluorescente (450 ?E.m-2.s-1) donde se regaban cada dos días a capacidad de campo. Durante 22 días las plantas fueron evaluadas, anotándose la incidencia de la enfermedad y la severidad, según la siguiente escala de valores: 0 plantas sanas, 1 plantas que presentaban síntomas leves, 2 plantas con síntomas severos, 3 plantas con síntomas muy severos y 4 plantas muertas.
Análisis de datos
Con los valores obtenidos de los síntomas que aparecían en las plantas se calculó el denominado Índice de Severidad de la Enfermedad, para lo cual se utilizó la siguiente fórmula:
Índice de severidad de la enfermedad (%)= Óni ? si ? 100 4 ?
N Siendo: ni: número de plantas afectadas por cada grado de severidad.
si: grado de severidad del ataque (0-4).
N: número total de plantas usadas para cada energía aplicada.
Para comparar la severidad de la enfermedad que apareció en los distintos tratamientos se representaron las Curvas de Progreso de la Enfermedad, para lo que se representaron en abscisas los días transcurridos tras la inoculación, y en ordenadas los Índices de Severidad de la Enfermedad expresados en porcentaje, calculados según la fórmula precedente.
A continuación se calcularon las Superficies Bajo la Curva de Progreso de la Enfermedad, mediante el sumatorio del producto de la media del grado de severidad entre dos observaciones consecutivas, por el número de días transcurridos entre dichas observaciones. El análisis de los datos obtenidos se realizó con el programa estadístico Statgraphics version 3.5, haciendo un Análisis Ordinario de Varianza (ANOVA), seguido de un Test de Rango Múltiple. Para estudiar la correlación entre la energía aplicada y la superficie bajo la Curva de Progreso de la Enfermedad se calculó el coeficiente de correlación de Pearson suponiendo que la distribución conjunta es normal bivariante.
Resultados
En la Figura 1 se presenta el efecto de la aplicación de energía con microndas en la evolución en el tiempo del Índice de Severidad de la Fusariosis del melón, representando en abscisas, de dos en dos días, los 22 días siguientes a la inoculación de las raíces de las plántulas con conidias de Fusarium oxysporum f.sp. melonis irradiadas con las diferentes cantidades de energía previstas en el ensayo y, en ordenadas, los correspondientes valores del Índice de Severidad de la Enfermedad expresados en porcentaje, calculados con la fórmula presentada.
En la Tabla 1 se presentan los valores medios de la Superficie Bajo la Curva de Progreso de la Enfermedad de los bloques correspondientes a los bloques de las plantas testigo, a los de las plantas inoculadas transcurridos 22 días después de haber sumergido sus raíces en soluciones de inóculo con 5.106 conidias/cm3 a las cuales se les habían aplicado mediante irradiación con microondas de 2.4 Ghz de frecuencia las cantidades de energía previstas y a los de las plantas control.
Discusión
En los ensayos para la obtención de la Curva de Progreso de la Enfermedad, es importante destacar que, en ningún caso, aparecieron diferencias significativas al nivel 95% entre los 4 bloques de 10 plantas/bloque usados con cada una de las diferentes cantidades de energía utilizadas en el ensayo, lo cual indica, de forma muy clara, que el tratamiento con microondas es una técnica de gran uniformidad en cuanto a la eficacia de su aplicación.
También ocurrió que, ni en las plantas control (no inoculadas), ni en las plantas que se inocularon con suspensiones de 5.106 conidias/ml a las que se le había aplicado una energía ? 24.000 Julios, aparecieron síntomas de la enfermedad. Esto indica, en primer lugar, que en los ensayos realizados no aparecieron contaminaciones indeseables, y en segundo lugar, lo cual es mucho más importante, que la irradiación con microondas del inóculo de Fusarium oxysporum f. sp. melonis, permite, si la energía aplicada es suficiente, su total erradicación. Es importante notar que la reducción de la severidad del ataque que produce el patógeno Fusarium oxysporum f. sp. melonis cuando se irradia con microondas, incluso cuando las aplicaciones de energía son reducidas, es considerable.
Esto indica, contrariamente a lo que ha sido expresado por otros autores cuando han utilizado la energía de las microondas para desinfestación de suelos (R. LAL, W.B. REED, S.O., 1988; NELSON, 1996, R.P. RICE, A.R.PUTHAM, 1977), que en el tratamiento de suspensiones conídicas de Fom no es necesaria una gran cantidad de energía para alcanzar resultados plenamente satisfactorios. También se deduce de la observación de las Curvas de Progreso de la Enfermedad, que la irradiación con microondas de las suspensiones de conidias de Fusarium oxysporum f. sp. melonis usadas para inocular las raíces de las plántulas de melón, sólo es capaz de controlar totalmente la enfermedad cuando la energía aplicada supera un cierto nivel.
En el caso ensayado debe ser ? 24.000 Julios. Por el contrario, cuando la cantidad de energía aplicada es inferior a la necesaria para destruir completamente el hongo, a medida que va pasando el tiempo tras la inoculación, van apareciendo plantas enfermas hasta que, en nuestro caso, transcurridos 22 días después de la inoculación, en las plantas infectadas por Fusarium oxysporum f. sp. melonis, aparecen elevados Índices de Severidad que, aunque disminuyen a medida que aumenta la cantidad de energía aplicada, indican que, cuando el inóculo no es destruido totalmente, es capaz de iniciar la enfermedad y provocar la muerte de la planta. También de la observación de las Curvas de Progreso de la Enfermedad se desprende que la irradiación con microondas, cuando se comparan las plantas testigo, inoculadas sus raíces por inmersión en una suspensión de 5.106 conidias/ ml no irradiada, con las plantas a las que se inocularon sus raíces por inmersión en suspensiones de 5.106 conidias/ml tratadas con cantidades de energía que no erradican el parásito, el periodo de incubación de la enfermedad se retrasa, en nuestro caso hasta 8 días, produciéndose más retraso en la aparición de síntomas de la enfermedad a medida que la energía aplicada fue mayor.
De la observación de los valores medios de cada bloque que ofrecen el Área Bajo la Curva de Progreso de la Enfermedad de los diferentes tratamientos, se desprende que, transcurridos 22 días tras la inoculación con conidias irradiadas, dichos valores pueden llegar a reducirse hasta en un 47%, y que la incidencia final de la enfermedad, cuando la energía irradiada fue suficiente como para eliminar completamente el patógeno, fue nula. De los datos de la Tabla 1 se desprende, según el coeficiente de correlación de Pearson, que existe una alta correlación negativa, entre la energía aplicada y la Superficie Bajo la Curva de Progreso de la Enfermedad. En conclusión, la irradiación con microondas de 2.45 GHz de frecuencia es un método rápido, eficiente, seguro, cómodo, no destructivo, no contaminante, libre de residuos, y que no produce riesgos ni para el operario que lo aplica, ni para posteriores usuarios de las plántulas producidas, que se puede considerar como una técnica capaz de combatir la Fusariosis en plántulas de melón durante el proceso industrial de producción de plantas para su trasplante al terreno de cultivo.
Agradecimientos: Los autores agradecen a la Consejería de Agricultura de la Junta de Comunidades de Castilla-La Mancha la subvención que les ha concedido para la ejecución de este trabajo.
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