Las cepas fúngicas pertenecientes a la micobiota dominante del arroz de Valencia Alternaria alternata y Drechslera oryzae se inocularon en un mismo sustrato y se incubaron en distintascondiciones de temperatura y actividad de agua con el objetivo de determinar las interaccionesa nivel macroscópico. A 25oC se produjo el mismo tipo de interacción en todas las actividadesde agua: Drechslera oryzae inhibió por contacto a A. alternata. Mientras que a 15oC el tipo deinteracción varió con la actividad de agua. El estudio ecofisiológico de A. alternata y D. oryzae registró para ambas especies un máximo y mínimo desarrollo a los valores de actividad deagua de 0.995 y 0.90, respectivamente.
INTRODUCCIÓN
Los hongos pueden interaccionar cuando coexisten en un mismo nicho ecológico dando lugar a distintos tipos de interacciones. Existen distintas clasificaciones a nivel macroscópico realizadas por los investigadores (MAGAN y LACEY, 1984; BODDY, 2000, etc.). Estas interacciones están sujetas a una gran cantidad de condicionantes intrínsecos propios al organismo como especie, metabolitos, velocidad de crecimiento, etc. o extrínsecos como sustrato, temperatura, actividad de agua, etc. En el caso de los cultivos, el conjunto de estos factores hará que se establezca o prevalezca una especie fúngica desarrollando una enfermedad.
Alternaria alternata (Fr.) Keissler y Drechslera oryzae (Breda de Haan) Subram. & Jain (telemorfo: Cochliobolus miyabeanus (Ito and Kurib.) Drechs.) son dos especies que se han aislado en un alto porcentaje en el arroz de Valencia y descritas también en otras zonas arroceras del mundo.
El objetivo del presente trabajo fue estudiar las interacciones fúngicas de las dos cepas en un mismo sustrato elaborado a partir de arroz cáscara en distintas condiciones de temperatura y actividad de agua. Al mismo tiempo se hizo un estudio ecofisiológico de las dos especies cuando se inocularon conjuntamente.
Materiales y métodos
Cepas fúngicas
Las cepas Alternaria alternata y Drechslera oryzae fueron aisladas en el laboratorio de Ecosistemas Agroforestales de la Escuela Técnica Superior del Medio Rural y Enología de muestras de granos de arroz de distintas parcelas y cooperativas de las principales zonas productoras de la provincia de Valencia.
Estudio ecofisiológico dual
Se utilizó Agar Extracto de Arroz (AEA) como medio base. Para ajustar la actividad de agua se añadieron distintas cantidades de glicerol y agua destilada (SEMPERE y SANTAMARINA, 2006a). El medio se esterilizó a 121ºC durante 20 minutos, posteriormente fue enfriado a 45-50ºC y repartido asépticamente en placas Petri de 90 y 150 mm.
A partir de las cepas A. alternata y D. oryzae inoculadas individualmente en Patata Dextrosa Agar (PDA) y crecidas a 25ºC durante cinco días, se extrajeron discos de 8 mm de diámetro.
Posteriormente se transfirieron en condiciones asépticas dos discos ?uno de cada especie- en cada una de las placas Petri a las distintas actividades de agua, separados por una distancia de 45 mm.
En total se realizaron 10 tratamientos combinando 5 actividades de agua (0.85, 0.90, 0.95, 0.98, 0.995) y dos temperaturas (15 y 25ºC).
Para mantener la actividad de agua durante el tiempo del experimento, placas con el mismo valor fueron puestas en cajas de polietileno conteniendo soluciones con la actividad de agua respectiva. Ésta se comprobó en todo momento, utilizado un Aqualab (Decagon, Inc., Pullman, WA, USA).
Durante cinco días se midió cada 24 horas el incremento radial de cada una de las especies con el objetivo de obtener las ratios de crecimiento (mm día-1) por medio de una regresión lineal de los radios (mm) frente al tiempo (días).
El programa utilizado fue Microsoft Excel 2003. Posteriormente se dejaron las placas durante ocho semanas para obtener el tipo de interacción.
El experimento se repitió cuatro veces.
Determinación macroscópica de las interacciones fúngicas
Después de obtener los gráficos del estudio ecofisiológico de las especies inoculadas conjuntamente, las placas Petri se dejaron durante 8 semanas, observando en todo momento la evolución macroscópica de las colonias y estableciendo el tipo de interacción. Al final de este periodo, cada hongo recibió un valor numérico para obtener el Índice de Dominancia: crecimiento en común (1); inhibición mutua por contacto o con espacio entre colonias < 2 mm (2); inhibición mutua a distancia (3); inhibición de un microorganismo por contacto (4 para la especie dominante, 0 para la especie inhibida); inhibición de un microorganismo a distancia (5 para la especie dominante, 0 para la especie inhibida) (MAGAN y LACEY ,1984).
Análisis estadístico
Para determinar el efecto de los factores abióticos actividad de agua (aw) y temperatura (Tª) y el factor biótico especie (E) y sus factores dobles sobre el crecimiento medio de A. alternata y D. oryzae inoculados conjuntamente, se realizó el test de análisis de la varianza (ANOVA) con valores de significación de P? 0.01. El programa utilizado fue STATGRAPHICS Plus 5.0 (Stat Point, Inc., Rendón, Virginia (EEUU)).
Resultados y discusión
Ratios de crecimiento de A. alternata y D. oryzae
Cuando se inocularon en un mismo sustrato A. alternata y D. oryzae presentaron un máximo crecimiento a 0.995 aw y 25ºC. La velocidad de crecimiento de las colonias fue incrementándose a medida que aumentó la actividad de agua dentro de una misma temperatura, aunque las ratios de crecimiento de D. oryzae a 15ºC fueron prácticamente iguales a las actividades de agua de 0.98 y 0.995 (Figura 1). El desarrollo de D. oryzae fue nulo a las actividades de agua de 0.85 y 0.90 y a ambas temperaturas durante el periodo en el que se registraron las medidas. Posteriormente, a esta última actividad de agua, sí que se observó un desarrollo de la especie. A. alternata, inicialmente creció a 0.90 aw y 25ºC pero el crecimiento de la cepa a 15ºC y a esta actividad de agua al igual que D. oryzae se produjo posteriormente. No se observó desarrollo a 0.85 aw.
A 25ºC a 0.995 aw y a 15ºC a las actividades de agua de 0.95 y 0.98 las velocidades de crecimiento de A. alternata fueron superiores a las registradas por D. oryzae (Figura 1).
Previamente se realizó un estudio ecofisiológico de las especies inoculadas individualmente (SEMPERE y SANTAMARINA, 2006a, b). Comparando ambos estudios, durante los cinco días en los que se realizaron las medidas no se observó una variación significativa entre las especies cuando se inocularon individualmente y conjuntamente. Durante las ocho semanas de experimentación, cuando A.alternata y D. oryzae contactaron si que se produjo una variación significativa de su crecimiento.
No se observaron cambios culturales de las especies cuando se inocularon conjuntamente.
Los factores simples actividad de agua, temperatura y el factor doble (awxTª) tuvieron un efecto significativo sobre el crecimiento medio de ambas especies (P<0.01) (Tabla 1).
Interacciones entre A. alternata y D. oryzae
En todas las actividades de agua y temperaturas estudiadas se obtuvo el mismo tipo de interacción, salvo a 15ºC a las actividades de agua de 0.98 y 0.995.
A 25ºC en todas las actividades de agua y a 15ºC a las actividad de agua de 0.95, D. oryzae inhibió a A. alternata por contacto. Ambas especies fueron creciendo hasta tocarse. Posteriormente, la especie inhibidora D. oryzae, continuó creciendo a través de la colonia inhibida de A. alternata, a una velocidad inferior a la registrada antes de contactar los micelios (Figuras 2 y 3).
Para obtener el Índice de Dominancia, en este tipo de interacción, se le asignó a D. oryzae un valor numérico de 4 (Tabla 2).
A 15ºC a 0.95 y 0.98 aw, se produjo una inhibición mutua por contacto. Las dos cepas fueron creciendo hasta tocarse y posteriormente se produjo un cese de su desarrollo en el frente de interacción. A cada especie se le asignó un valor numérico de 2.
Alternaria alternata, ha sido enfrentada en otros sustratos y condiciones medioambientales a distintas especies. De esta forma, Valero et al. (2006), estudiaron la interacción de ésta con cepas del género Aspergillus en un medio sintético a 20ºC y 30ºC a la actividad de agua de 0.97. A ambas temperaturas, A. alternata inhibió por contacto a Aspergillus japonicus y a dos cepas de Aspergilluscarbonarius, pero al crecer junto A. niger el tipo de interacción varió de 30ºC a 20ºC, produciéndose un crecimiento en común. En otro ensayo, Lee y Magan (2000) encontraron que A. alternata inhibió por contacto a Aspergillusochraceus en todas las condiciones ensayadas, salvo cuando cambió la actividad de agua a 18ºC.
Cuando A. alternata se enfrentó a N. oryzae, otra especie perteneciente a la micobiota del arroz de Valencia en las mismas condiciones de temperatura y actividad de agua y en AEA, no hubo una variación del tipo de interacción produciéndose en todos los casos un crecimiento en común, no siendo ninguna especie dominante sobre la otra (SEMPERE y SANTAMARINA, 2006b).
Según el Índice de Dominancia, en la presente investigación, D. oryzae fue una especie dominante sobre A. alternata en las dos temperaturas ensayadas (Tabla 2).
Éste ensayo pone de manifiesto que las interacciones fúngicas están supeditadas a distintos factores entre ellos, la actividad de agua, la temperatura, las especies enfrentadas y el sustrato.
BIBLIOGRAFÍA
BODDY, L. (2000). Interspecific combative interactions between wood-decayingbasidiomycetes. FEMS Microbiology Ecology 31, 185-194.
LEE, H.B.; MAGAN, N. (2000) Impact of environment and interspecific interactions between spoilage fungi and Aspergillus ochraceus on growth and ochratoxin production in maize grain. International Journal of Food Microbiology 61, 11-16.
MAGAN, N.; LACEY, J. (1984) The effect of water activity, temperature and substrate on interactions between field and storage fungi. Transactions of the British Mycological Society 82, 83?93.
SEMPERE, F.; SANTAMARINA, P. (2006a) Ecofisiología de Drechslera oryzae Subram. & Jain en condiciones in vitro. PHYTOMA 178, 49-50.
SEMPERE, F.; SANTAMARINA, P. (2006b) Microscopic and macroscopic study of the interaction between Alternaria alternata (Fr.) Keissler and Nigrospora oryzae (Berk. & Broome) Petch. Annals of Microbiology 56, 101-107.
VALERO, A.; SANCHIS, V.; RAMOS, A.J.; MARÍN, S. (2006) Studies on the interaction between grape associated filamentous fungi on a synthetic medium. International Journal of Food Microbiology 110, 160 164.
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