INTRODUCCIÓN
El remedio más eficaz para corregir la clorosis férrica (ver Foto 1) es la utilización de quelatos sintéticos de hierro, especialmente los derivados de los ácidos poliaminocarboxílicos (CHEN Y BARAK, 1982; LUCENA, 2003). El ácido etilendiamino- N,N?(o-hidroxifenilacético) (o,oEDDHA) es uno de los agentes quelantes de Fe3+ más empleado. Forma un complejo 1:1 con el Fe3+ (Figura 1) de elevada solubilidad en agua y estabilidad en un amplio intervalo de pHs (BANNOCHIE Y MARTELL, 1989). Comúnmente la producción de quelatos Fe3+-EDDHA a nivel industrial se lleva a cabo mediante adición de sales férricas o ferrosas a EDDHA sin purificar inmediatamente después de ser sintetizado. Así en las formulaciones comerciales existen otros isómeros ?OH posicionales además de o,oEDDHA: o,oEDDHA (mayoritario), o,pEDDHA y p,p- EDDHA. Este último no compleja hierro e incluso es capaz de degradarse en la síntesis, luego sólo los dos primeros, el orto-orto y el orto- para (Figura 1) tienen interés.
Dado el buen comportamiento agronómico de productos comerciales conteniendo ambos quelatos o,oEDDHA/Fe3+ y o,pEDDHA/Fe3+, la legislación europea vigente sobre fertilizantes (Regulación EC Nº 2003/2003) incluye como novedad dentro de los agentes quelantes permitidos para quelar hierro, el o,pEDDHA. Es por eso que el grupo de trabajo que dirijo en la UAM ha comenzado a investigar sobre el comportamiento y acción agronómica del o,pEDDHA/Fe3+ utilizado como quelato aislado o en combinación con o,oEDDHA/Fe3+. Para que un quelato férrico sea eficaz para aportar hierro a las plantas debe, según el esquema 1:
- Ser suficientemente estable como para que el metal no sea sustituido por otro elemento en las condiciones del suelo (I).
- No quedar retenido en las superficies del suelo, o en caso de retención que sea reversible (II).
- Ceder el hierro rápidamente a las raíces de las plantas para que estas lo puedan tomar, dejando libre el agente quelante(III)
- Su agente quelante debe ser capaz de recargarse rápidamente con hierro, de modo que pueda removilizar Fe nativo del suelo (IV).
Además su persistencia en el suelo dependerá de la degradación que pueda sufrir y de los procesos de lixiviación. El objetivo concreto de este trabajo es proporcionar información sobre las características del quelato o,pEDDHA/Fe3+ en cuanto a su estabilidad, retención en el suelo, absorción por la planta y redisolución del hierro.
Estabilidad en disolución
Para estudiar la estabilidad en disolución del o,pEDDHA/Fe3+ se diseñó un modelo de especiación química que permite simular el comportamiento en el suelo o en disoluciones nutritivas del quelato. Para ello se determinaron las constantes de estabilidad de todas las reacciones en las que el quelato puede intervenir y con estos datos se simuló su comportamiento en suelos y disoluciones nutritivas mediante el uso del programa MINTEQA2. En la Figura 2 se presentan los diagramas teóricos de estabilidad del o,pEDDHA/Fe3+ comparándolos con quelatos EDTA/Fe3+, y o,oEDDHA/Fe3+.
La principal información que se puede obtener es que mientras el principal competidor del EDTA/Fe3+ es el Ca2+, catión muy abundante en todos lo suelos, para el o,pEDDHA/Fe3+ el principal competidor es el Cu2+. Dado que el Cu es un micronutriente, en condiciones normales de suelos (línea 1 en la Figura 2) no va apenas a afectar al quelato o,pEDDHA/ Fe3+. Sólo en un suelo con una disponibilidad ilimitada de Cu (alta contaminación), éste podría desplazar al Fe del quelato (línea 2 de la Figura 2.
Así se puede afirmar que a pH normales de suelos calizos el quelato o,pEDDHA/Fe3+ es estable y no va ha sufrir competencias catiónicas relevantes, el quelato o,oEDDHA/Fe3+ presenta elevada estabilidad y sin embargo el EDTA/Fe3+ se decompone. Los datos predichos en el modelo teórico se verifican cuando se hace interaccionar en el laboratorio los quelatos mencionados con distintos suelos. Así en la figura 3 se recoge el quelato que permanece en disolución después de tres días de interacción con tres suelos. Aunque las diferencias no son tan grandes como en el modelo teórico si se aprecia una mayor estabilidad en disolución del o,pEDDHA/Fe3+ frente al EDTA/Fe3+ y menor que la del o,oEDDHA/Fe3+. En el modelo teórico la pérdida de hierro del quelato sólo se puede atribuir a la precipitación del hierro (I en el Esquema 1), pero en los experimentos de interacción también se estudia las reacciones de adsorción (II en el Esquema 1).
El o,pEDDHA/ Fe3+ presenta formas neutras (la FeHo,pEDDHAo, YUNTA et al, 2003) además de las negativas que presentan el resto de los quelatos (Feo,pEDDHA-, Feo,oEDDHA-, FeEDTA-). Esta forma neutra puede ser retenida más fácilmente que las negativas, luego es posible que las disminuciones observadas en el o,pEDDHA/Fe3+ sean consecuencia de una adsorción reversible y que no haya pérdida neta de quelato. De hecho, cuando se hacen interacciones más fuertes, como es en el caso de columnas de lixiviación (datos no mostrados) la cantidad de quelato o,pEDDHA/Fe3+ que se lixivia en un suelo calizo es mínima. El suelo de Sudanell presentaba una elevada disponibilidad de Cu como consecuencia del uso masivo de fungicidas cúpricos a lo largo de los años, lo que hace que tenga una mayor interacción con el o,pEDDHA/Fe3+, sin embargo se comprueba que este elemento no es capaz de desplazar todo el Fe del quelato.
Capacidad de o,pEDDHA/Fe3+ para ceder Fe a las plantas
Se pretende profundizar en el comportamiento del quelato o,pEDDHA/Fe3+ para aportar Fe a las plantas y para ello se plantearon dos tipos de ensayos. En el primero se determinó la actividad Fe-quelato reductasa (proceso III en el Esquema 1) en plantas de pepino ligeramente estresadas, con lo que se pretende establecer diferencias en la eficacia entre los distintos quelatos ensayados, siendo uno de ellos el o,pEDDHA/Fe3+. En un segundo ensayo se comparó la aplicación de o,pEDDHA/Fe3+ sólo o en diferentes combinaciones con o,oEDDHA/Fe3+ en plantas de soja cloróticas.
Determinación de la capacidad reductora de raíces de pepino
La actividad Fe-quelato reductasa se determinó empleando plántulas de pepino (Cucumis sativus L. cv. Ashley). Esta planta presenta una elevada respuesta a la clorosis. Las plantas se desarrollaron en hidroponía. El pH se ajustó a 7,5 con KOH 1M y se tamponó con CaCO3. Para la medida de la actividad quelato reductasa se utilizó como sustrato de la enzima 100 ?M de Fe en forma de los quelatos EDTA/Fe3+, o,oEDDHA/Fe3+, o,pEDDHA/Fe3+ y el quelato comercial Sequestrene (conteniendo o,oEDDHA/Fe3+ y o,pEDDHA/Fe3+) y se midió el Fe(II) producido a los 10, 20 y 60 minutos, mediante la formación del complejo coloreado Fe(II)BPDS3. Se realizaron 5 repeticiones por cada sustrato.
La actividad de la enzima reductasa informa de la velocidad con que las plantas reducen el hierro a partir de o,pEDDHA/Fe3+ (Figura 4). El o,pEDDHA/Fe3+ es el mejor sustrato para el enzima. La secuencia es o,pEDDHA/Fe3+ > Sequestrene > EDTA/Fe3+ > o,oEDDHA/Fe3+, aunque las diferencias son significativas sólo en el caso del o,pEDDHA/Fe3+ para ?=0.05. Esto implica que a igualdad de concentración de quelato en la rizosfera de la planta de pepino, ésta es capaz de reducir el hierro casi 10 veces más rápido a partir de o,pEDDHA/Fe3+ que de o,oEDDHA/Fe3+ (en otros experimentos ha sido 4 veces más rápida).
El Sequestrene, que posee una cierta cantidad de o,pEDDHA/Fe3+, además del o,oEDDHA/ Fe3+ presenta mejor comportamiento que el o,oEDDHA/Fe3+, e intermedio entre ambos isómeros.
Determinación de la absorción de Fe por plantas de soja estresadas
En el segundo ensayo se utilizaron plantas de soja (Glycine max L. cv Oshumi) que son susceptibles a la clorosis, por lo que son un buen modelo para estudiar la aplicación de quelatos. Fueron cultivadas en hidroponía y cámara de cultivo (16 horas de día a 30ºC de temperatura y 50% de humedad y, 8 horas de noche a 25ºC de temperatura y 70% de humedad) durante 16 días y a las que se les indujo la clorosis férrica en los 6 últimos días. En la disolución empleada el pH se tamponó a 7.5 con HEPES 0.1 mM, 0.05 mM KOH y 1g de CaCO3/L. Pasado ese tiempo adicionaron los tratamientos (Tabla 1) que se realizaron por cuadriplicado. Con los tratamientos T0, T1 y T2 se pretende comparar la velocidad de recuperación a partir de o,pEDDHA/Fe3+ en bajas concentraciones en comparación con o,oEDDHA/ Fe3+.
Dado que en los productos comerciales o,pEDDHA/Fe3+ está presente junto con o,oEDDHA/ Fe3+ con los tratamientos T2 a T5 se pretendía comprobar el efecto de adiciones de o,pEDDHA/Fe3+ sobre o,oEDDHA/Fe3+. Igualmente la comparación de los tratamientos T5 y T6 nos informará de si el efecto que se observara con el uso combinado de o,pEDDHA/Fe3+ y o,oEDDHA/Fe3+ es específico de este quelato o no. Se mantuvieron durante 14 días, al cabo de los cuales, las plantas se muestrearon y lavaron (ÁLVAREZ-FERNANDEZ y col., 2001). Se determinó el peso fresco y peso seco de parte aérea y raíz de forma separada, y se procedió a la digestión del material vegetal, en donde se determinó el contenido de micronutrientes mediante absorción atómica.
Tras la aplicación de los tratamientos, se midió el índice SPAD en todas las hojas mediante un equipo Minolta SPAD 502. En la Tabla 2 se presentan los datos biométricos obtenidos a las dos semanas de la aplicación de los tratamientos. En la Foto 2 se aprecia la comparación de los tratamientos T0, T1 y T2 a los 7 días de iniciarse los ensayos. Es patente la mejor respuesta del o,pEDDHA/Fe3+ que en una semana ha sido capaz de corregir la clorosis de las plantas. Estos resultados se corresponden los obtenidos en los datos biométricos (Tabla 2 para T0, T1 y T2), para las variaciones el índice de Clorofila obtenido durante el experimento (Figura 5) y concentración de Fe al final del ensayo (Figura 6).
Los datos de variación del índice SPAD presentados en la Figura 5 ponen de manifiesto cómo el control pierde clorofilas hasta el final del ensayo, el o,oEDDHA/Fe3+ limita da disminución desde el 4º día, pero el tratamiento con o,pEDDHA/Fe3+ implica un aumento importante de clorofilas desde el 2º día. Igualmente la concentración de Fe es significativamente superior en las plantas tratadas con o,pEDDHA/Fe3+ 5 ?M (T1). La mayor concentración de Fe en las plantas tratadas con o,oEDDHA/Fe3+ respecto el control sin Fe no se ha traducido a las dos semanas en un incremento en el tamaño (ver Tabla 2). Dado que en los productos comerciales el o,pEDDHA/Fe3+ siempre va asociado al o,oEDDHA/ Fe3+ y puesto que el o,pEDDHA/Fe3+ presenta una menor estabilidad (YUNTA y col., 2001) frente al o,oEDDHA/Fe3+, no se plantea la adición individual del mismo, sino en combinación con el o,oEDDHA/Fe3+, que al presentar una mayor estabilidad podría actuar a largo plazo. Así, se establecieron diferentes combinaciones entre ambos agentes quelantes (T2 a T5). En la fotografía 3 se presenta el aspecto visual a la semana de aplicación de los tratamientos. Es evidente que hay una respuesta muy positiva al incremento de o,pEDDHA/ Fe3+ sobre o,oEDDHA/Fe3+, incluso en la dosis más baja (1?M). Los datos biométricos (Tabla 2), así como los datos de SPAD (Figura 7) y concentración de Fe en hoja confirman este efecto positivo (Figura 8).
Los datos de Fe obtenidos (Figura 8) permiten concluir que la mezcla o,pEDDHA/Fe3+ y o,oEDDHA/ Fe3+ aumenta el contenido de Fe en hojas de forma significativa, siendo la combinación 50:50 la que mejores resultados aporta, dentro de las ensayadas. Los resultados obtenidos tras los 14 días de tratamiento muestran que el o,pEDDHA/Fe3+ tiene una mayor rapidez de acción que el o,oEDDHA/Fe3+. Ésta puede estar relacionada con su mejor capacidad para ser sustrato de la enzima Fe-quelato reductasa o simplemente por la mayor facilidad de cesión del hierro al cultivo no eficiente de soja. Para comprobar si este efecto es propio de la combinación de o,pEDDHA/Fe3+ con o,oEDDHA/Fe3+ o si también lo presenta el propio o,oEDDHA/Fe3+3+ se compararon los tratamientos o,pEDDHA/Fe3+ 5 ?M + o,oEDDHA/Fe3+5 ?M con otro conteniendo la misma cantidad de Fe pero sólo en la forma de o,oEDDHA/Fe3+ (o,oEDDHA/Fe3+ 10?M). Así en la Figura 9 se presentan los resultados de Fe acumulado en el tejido foliar para estos tratamientos, pudiéndose observar que la mezcla o,oEDDHA/Fe3+ y o,pEDDHA/Fe3+ da resultados significativamente mejores que si los 10 ?M de Fe se añaden todos como o,oEDHA/Fe3+.
Determinación de la velocidad de disolución de Fe del suelo por el agente quelante o,pEDDHA
Para que el efecto transportador del hierro nativo del suelo (proceso IV en el Esquema 1) sea efectivo el agente quelante debe ser capaz de disolver el Fe del suelo a una velocidad adecuada. Se midió esta velocidad para disoluciones de EDTA, o,pEDDHA y o,oEDDHA en concentración 10-4 M tamponadas con HEPES a pH =8 después de reaccionar durante 1, 2, 4, 8 horas, 1, 2, 4, 8, 15, 32 y 64 días con tres óxidos de hierro (óxido amorfo, maghemita y goetita, que fueron sintetizados en el laboratorio según el procedimiento descrito por Schwertmann y Cornell (1991) y tres suelos, un patrón de suelo calizo preparado en el laboratorio y dos suelos agrícolas que sustentan cultivos con problemas de clorosis.
Para realizar el estudio cinético se empleó la ecuación de Langmuir modificada para relacionar la cantidad solubilizada frente al tiempo: Siendo x/m = cantidad de Fe solubilizada por unidad de masa (?mol·g-1); k1 y k2 = constantes y t = tiempo de interacción (días). De igual forma se pueden definir dos parámetros muy útiles para este tipo de ensayos: T1/2 = 1/k2 que es el tiempo empleado para solubilizar la mitad de la máxima concentración del metal. Y Mmax = k1/k2 , que es la concentración máxima del metal M que se disuelve. Ahí donde se observó degradación de los productos se empleó una ecuación con dos términos para distinguir el proceso de solubilización del de degradación.
En la Figura 10 se presenta el T1/2 para algunos de los materiales ensayados. Hay que tener en cuenta que cuanto menor es el parámetro T1/2 más rápido será el proceso de solubilización del hierro. Se puede observar como en todos los casos es el agente quelante o,pEDDHA el más rápido. El o,oEDDHA es el más lento en suelo mientras que el EDTA lo es en óxidos de Fe y suelo de Sudanell. La rápida solubilización por el o,pEDDHA se podría explicar en base a su estructura molecular, ya que al presentar una estructura más abierta, el proceso de quelación sería más rápido. Una más rápida solubilización del Fe del suelo por parte del o,pEDDHA puede suponer una mayor capacidad de dicho agente quelante para transportar el Fe desde el suelo a la planta. En cuanto a la Mmáx es en general superior para el o,oEDDHA seguida del o,pEDDHA y siendo para el EDTA muy baja debido a la formación del quelato cálcico, favorecida en las condiciones experimentales. Este orden es el mismo que el de la estabilidad de los quelatos formados.
Conclusión
Los resultados aquí mostrados explican la idea de que el quelato férrico de o,pEDDHA presenta ciertas ventajas agronómicas relacionadas con su velocidad de acción: Es un sustrato más adecuado para la reductasa, recupera más rápidamente la clorosis en plantas cultivadas en hidroponía y su agente quelante es capaz de solubilizar Fe nativo del suelo más rápidamente que otros quelantes. Además ha quedado demostrado que su estabilidad en suelos calizos es suficiente para asegurar su permanencia a corto plazo en el suelo. Los buenos resultados de campo obtenidos con el uso quelatos comerciales con la mezcla o,oEDDHA/Fe3+ y o,pEDDHA3+ son explicables por la rápida acción del o,pEDDHA3+ y el efecto duradero del o,oEDDHA/Fe3+.
Agradecimientos
Al Dr. Felipe Yunta por el cálculo de especiación y a la Lda Noelia Martínez por el desarrollo de los cultivos.
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